"Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием иммунохроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия). Методические рекомендации"
(утв. Минздравом России 04.03.2004 N 24ФЦ/976)

1. Разработаны: Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Брагина И.В., Кривопалова Н.С, Минаева Н.А.), Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии (Котляров В.М., Фирсова Т.Е., Чевелева С.С.), МУП "Уфаводоканал" (Кантор Л.И., Труханова Н.В., Майтова Р.Ф.), центром госсанэпиднадзора в Южном Административном округе г. Москвы (Митрофанова Т.А., Чернявский Г.И., Гудков А.А.), фирмой "Лаб-БиоМед" (Соколов Д.М., Кашинцев И.В.).

2. Утверждены и введены в действие Заместителем главного государственного санитарного врача Российской Федерации - Главным врачом Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н. Беляевым 04.03.2004 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические рекомендации устанавливают методы проведения лабораторных исследований по выявлению бактерий рода Salmonella, Listeria monocytogenes, Campylobacter, E. coli O157:H7, веротоксинов энтерогеморрагических штаммов E. coli с использованием иммунохроматографических экспресс-тестов и в пищевых продуктах и продовольственном сырье, водных объектах окружающей среды и биоматериале от человека.

1.2. Методические рекомендации разработаны в соответствии с Федеральным законом "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, Положением о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации.

1.3. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль продовольственного сырья и пищевых продуктов в лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и санитарно-эпидемиологической службы федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих государственный и ведомственный контроль, а также в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения испытаний указанной продукции для целей сертификации.

2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ от 30 марта 1999 г.

2.2. Закон РФ "О защите прав потребителей" от 7 февраля 1992 г.

2.3. Закон РФ "О качестве и безопасности пищевых продуктов" N 29-ФЗ от 2 января 2000 г.

2.4. "Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.5 "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.6. СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами.

2.7. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов".

2.8. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".

2.9. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".

2.10. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований".

2.11. ГОСТ 30519-97/ГОСТ Р 50480-93 "Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella."

2.12. МУ 2.1.5.800-99 Организация госсанэпиднадзора за обеззараживание сточных вод.

2.13. МУК 4.2.992-00 от 04.11.2000 г. Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157-H7

2.14. ГОСТ 51921-2002 Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes.

2.15. МУК 4.2.1122-02 Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах.

2.16. МУ N 04-23/3 от 17.12.84 г. Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний вызываемых энтеробактериями.

2.17. Инс. N 15-6/28 от 21.11.89 г. Инструкция по клинической и лабораторной диагностике кампилобактериоза.

2.18. ГОСТ 19569-89 Стерилизаторы паровые медицинские. Общие технические требования и методы испытаний.

2.19. ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.

2.20. ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.

2.21. ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия.

2.22. ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.

2.23. ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия.

2.24. ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия.

3.1. Требования безопасности, общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура должны удовлетворять требованиям СП 1.2.731, ГОСТ Р 51446.

3.2. Лаборатория должна иметь разрешение на работу с микроорганизмами III - IV групп патогенности.

--------------------------------

<*> Производство питательных сред и экспресс-тестов компании Merck KGaA (Германия) имеет международный сертификат качества ISO 9001:2000.

Допускается использование оборудования импортного производства аналогичного назначения.

Иммунохроматографические экспресс-тесты Singlepath и Duopath предназначены для выявления бактерий рода Salmonella, Listeria, E. coli O157 и веротоксинов энтерогеморрагических штаммов E. coli.

Экспресс-тесты представляет собой диагностическую тест-панель с лункой для внесения образца, и окном с тестовой и контрольной зонами. Экспресс-тест содержит иммобилизованные на подложке меченые золотом антитела, обладающие высокой специфичностью к определяемым бактериям или веротоксинам.

Принцип действия экспресс-тестов основан на методе визуальной иммунохроматографии - разновидности иммуноферментного анализа. Антигены определяемых бактерий или веротоксинов, присутствующие в исследуемом образце, взаимодействуют с мечеными золотом антителами с образованием комплекса антиген-антитело. При прохождении по подложке теста комплекс антиген-антитело связывается с иммобилизованными антителами с образованием красных линий в тестовой и контрольной зонах.

Метод выявления бактерий рода Salmonella, Listeria, E. coli O157:H7 и веротоксинов энтерогеморрагических штаммов E. coli основан на визуальном определении наличия линий в тестовой и контрольной зонах Singlepath и Duopath тестов при исследовании предварительно обогащенного образца.

Отбор и подготовку проб проводят в соответствии с ГОСТ 26668, ГОСТ 26669 и другими действующими ГОСТ и НД на анализируемый вид образцов. Биоматериал - в соответствии с МУ N 04-23/3.

8.1.1. Singlepath-Listeria тест (4.12).

8.1.2. Бульон Фразера (п. 4.13).

8.1.3. Забуференный бульон для обогащения листерий (BLEB) (п. 4.14).

8.1.4. ПАЛКАМ агар (п. 4.15).

8.1.5. ОКСФОРД агар (п. 4.16).

Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.

Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см³ вносят в 225 см³ бульона Фразера половинной концентрации (п. 8.1.2). При необходимости анализа других масс (объемов) образца их посев проводят в бульон Фразера половинной концентрации в соотношении 1:9 по объему.

Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).

Посевы инкубируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч.

0,1 см³ обогащенной культуры после инкубирования по п. 8.2, перенести в 9,9 см³ бульона Фразера (п. 8.1.2) или забуференного бульона для обогащения листерий (BLEB) (8.1.3).

Посевы инкубировать при температуре (30 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч.

1 - 2 см³ культуры, полученной после селективного обогащения по п. 8.3 перенести в пробирку. Инактивировать обогащенную культуру на водяной бане при температуре 80 °C в течение 20 мин.

Оставшуюся после селективного обогащения культуру (п. 8.3) использовать для подтверждения положительных результатов.

Инактивированную культуру по п. 8.4. охладить до комнатной температуры. Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 8.1.1).

Считать результаты через 20 минут. Проверить наличие линий в тестовой (T) и контрольной (C) зонах Singlepath-теста.

Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.

Примечание: нижний предел чувствительности метода - 10⁴ - 10⁶ бактерий/см³.

Положительные результаты подтвердить, используя дифференциально-диагностические среды - ПАЛКАМ агар (п. 8.1.4) или ОКСФОРД агар (п. 8.1.5), в соответствии ГОСТ Р 51921 или МУК 4.2.1122.

Испытания проводить по схеме N 1.

9.1.1. Singlepath-Salmonella тест (п. 4.17)

9.1.2. Забуференная пептонная вода (п. 4.18).

9.1.3. Среда Раппапорт-Василиадис (магниевая) (п. 4.19).

9.1.4. Селенитовая среда (4.20).

9.1.5. Тетратионатная среда (4.21).

9.1.6. РАМБАХ-агар (п. 4.22).

9.1.7. Salmosyst (п. 4.23).

9.1.8. Salmosyst селективная добавка (п. 4.24).

Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.

Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см³ вносят в 225 см³ забуференной пептонной воды (п. 9.1.2). При необходимости анализа других масс (объемов) образца их посев проводят в забуференную пептонную воду в соотношении 1:9 по объему.

Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).

Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч

0,1 см³ обогащенной культуры после инкубирования по п. 9.2 перенести в 9,9 см³ среды Раппапорт-Василиадис (п. 9.1.3).

Посевы инкубировать при температуре (41 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч

1 - 2 см³ культуры, полученной после селективного обогащения по п. 9.3 перенести в пробирку. Инактивировать обогащенную культуру на водяной бане при температуре 100 °C в течение 15 мин.

Оставшуюся после обогащения по п. 9.3 культуру использовать для подтверждения положительных результатов.

Инактивированную культуру по п. 9.4. охладить до комнатной температуры.

Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 9.1.1).

Считать результаты через 20 минут.

Проверить наличие линий в тестовой (T) и контрольной (C) зонах Singlepath-теста.

Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.

Примечание: нижний предел чувствительности метода 10⁴ - 10⁷ бактерий/см³.

Положительные результаты подтвердить, используя хромогенную среду РАМБАХ-агар (п. 9.1.6), с последующей идентификацией сальмонелл по ГОСТ 30519.

Испытания проводить по схеме N 2.

10.1.1. тест

10.1.2. Модифицированный EC бульон с новобиоцином - mEC (п. 4.25).

10.1.3. Модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином - mTSBN (п. 4.26).

10.1.4. Агар Мак Конки с сорбитолом - SMAC agar (4.27).

10.1.5. Агар Мак-Конки с сорбитолом усиленной селективности - CT-SMAC Agar (4.33).

Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.

Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см³ вносят в 225 см³ модифицированный EC бульон с новобиоцином - mEC (п. 10.1.2) при исследовании мясных продуктов или модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином - mTSBN (п. 10.1.3) при исследовании молочных продуктов.

При необходимости анализа других масс (объемов) образцов их посев проводят в одну из селективных сред в соотношении 1:9 по объему.

Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).

Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч

1 - 2 см³ культуры, полученной после предварительного обогащения по п. 10.2 перенести в пробирку. Инактивировать обогащенную культуру на водяной бане при температуре 100 °C 15 мин.

Инактивированную культуру по п. 10.3. охладить до комнатной температуры.

Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 10.1.1).

Считать результаты через 20 минут. Проверить на наличие линий в тестовой (T) и контрольной (C) зонах Singlepath-теста.

Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.

Примечание: нижний предел чувствительности метода 10⁴ - 10⁶ бактерий/см³.

Положительные результаты подтвердить, используя SMAC-агар (п. 10.1.4) или CT-SMAC-агар (10.1.5), с последующей идентификацией в соответствии с МУК 4.2.992.

Испытания проводить по схеме N 6.

11.1.1. тест (п. 4.28)

11.1.2. Селективный бульон Болтона (п. 4.29)

11.1.3. Газогенерирующие пакеты - Anaerocult-C (4.30)

11.1.4. Campylobacter селективный агар (п. 4.31).

Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.

Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см³ вносят в 225 см³ селективного бульона Болтона (п. 11.1.2);

При необходимости анализа других масс (объемов) образца их посев проводят в селективный бульон Болтона соотношении 1:9 по объему.

Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).

Объем воздуха во флаконе (пробирке) после посева не должен превышать 10 - 15%. Если объем воздушного пространства превышает 15%, то культивирование ведут в микроаэрофильных условиях, используя для этого газогенерирующие пакеты Anaerocult-C (п. 11.1.3).

Посевы инкубируют в два этапа:

- первый этап при температуре (37 +/- 1) °C в течение 4 ч.

- второй этап при температуре (41 +/- 1) °C в течение (44 +/- 2) ч

1 - 2 см³ культуры, полученной после селективного обогащения по п. 11.2 перенести в пробирку. Инактивировать обогащенную культуру на водяной бане при температуре 100 °C в течение 15 мин.

Оставшуюся после обогащения по п. 11.2 культуру использовать для подтверждения положительных результатов.

Инактивированную культуру по п. 11.3. охладить до комнатной температуры.

Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 11.1.1).

Через 20 минут считать результаты. Проверить наличие линий в тестовой (T) и контрольной (C) зонах Singlepath-теста.

Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.

Нижний предел чувствительности метода примерно 10⁴ - 10⁷ бактерий/см³.

Положительные результаты подтвердить, используя Campylobacter селективный агар (п. 11.1.4), с последующей идентификацией в соответствии с Инструкцией N 15-6/28.

Испытания проводить по схеме N 7.

11.2.1. тест (п. 4.32)

11.2.2. Модифицированный EC бульон с новобиоцином - mEC Broth (п. 4.25)

11.2.3. Модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином - mTSBN (п. 4.26)

11.2.4. Агар Мак-Конки с сорбитолом усиленной селективности - CT-SMAC Agar (п. 4.33).

11.2.5. CAYE бульон (п. 4.34)

11.2.6. Раствор полимиксина 0.5% (п. 4.35)

Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.

Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см³ вносят в 225 см³ модифицированный EC бульон новобиоцином - mEC (п. 10.1.2) при исследовании мясных продуктов или модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином - mTSBN (п. 10.1.3) при исследовании молочных продуктов.

При необходимости анализа других масс (объемов) образцов их посев проводят в одну из селективных сред в соотношении 1:9 по объему.

Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).

Посевы инкубировать при температуре (41 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч

После инкубирования по п. 12.2. обогащенную культуру пересеять на поверхность CT-SMAC агара (12.1.4).

Посевы инкубировать при температуре (37 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч

После инкубирования по п. 12.3 внести 5 - 6 типичных колоний E. coli O157 в 1 см³ CAYE бульона (п. 12.1.5), содержащий индуктор синтеза веротоксинов.

Посевы инкубировать при температуре (37 +/- 1) °C в течение 6 часов.

Перенести 180 мкл культуры, полученной по п. 12.4 в пробирку-эппендорф. Добавить 20 мкл раствора полимиксина (п. 12.1.6) и перемешать.

Инкубировать при температуре (37 +/- 1) °C в течение 10 мин.

Инактивированную культуру по п. 12.5. охладить до комнатной температуры и перемешать с помощью миксера Vortex.

Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 12.1.1).

Считать результаты через 20 минут. Проверить на наличие линий в тестовой (VT1 и VT2) и контрольной (C) зоне Duopath-теста.

Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (VT1 и/или VT2), так и в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.

Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (VT1 и VT2), так и в контрольной (C) зоне.

Испытания проводить по схеме N 8.