"МУК 4.2.2788-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа. Дополнение 1 к МУК 4.2.1955-05 "Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа". Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 06.12.2010)

1. Разработаны ГУ Научно-исследовательским институтом питания РАМН; ГУ Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; при участии фирмы ООО "Ниармедик плюс".

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиобиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 декабря 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Внести дополнения в МУК 4.2.1955-05:

1. Раздел 2. "Общие положения и область применения" дополнить пунктами 2.7 и 2.8 следующего содержания:

2.7. Настоящие методические указания устанавливают также метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе твердофазного гетерогенного гибридизационного ДНК-РНК анализа с хемилюминесцентным детектированием. Метод может применяться в качестве дополнительного к классическим бактериологическим методам лабораторных исследований для целей выявления бактерий Listeria monocytogenes при контроле пищевых продуктов.

2.8. Метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-2001 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе.

2. Раздел 3. "Сущность метода" дополнить пунктами 3.6, 3.7 и 3.8 следующего содержания:

3.6. Метод выявления бактерий Listeria monocytogenes предусматривает высев определенных количеств исследуемых образцов молока и молочных продуктов в специальную селективную питательную среду, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, обработку культуральной жидкости лизирующим буфером, денатурацию бактериальной рибосомальной РНК, гибридизацию фрагментов денатурированной рРНК с комплементарным ей меченым зондом, входящим в набор "Люмипроб-24 Listeria monocytogenes", хемилюминесцентным детектированием продуктов реакции.

3.7. При обнаружении положительных результатов присутствие бактерий Listeria monocytogenes должно подтверждаться в соответствии с методами ГОСТ Р 51921-2002 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes" или МУК 4.2.1122-02 "Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах".

3.8. Мишенью в реакции ДНК-РНК гибридизации для Listeria monocytogenes является последовательность ДНК, кодирующая токсический белок листериолизин-О - основной фактор патогенности Listeria monocytogenes.

3. Раздел 10. "Нормативные ссылки" дополнить пунктом 10.19 следующего содержания:

10.19. МУК 4.2.1955-05 "Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа".

4. Методические указания дополнить разделом 11 с названием "Проведение анализа по обнаружению бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах" следующего содержания:

Набор "Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes" на 50 тестов в составе:

Примечание. Допускается использование других питательных сред, реактивов, диагностических препаратов, аппаратуры и инструментария с аналогичными характеристиками, прошедших регистрацию в Российской Федерации в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

Питательные среды и биологические препараты отечественного и зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

1. Изотонический (0,85%-ный водный) раствор хлорида натрия (ГОСТ 26669-85).

Приготовление среды RM L Broth: навеску 52 г растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, осторожно перемешивают до растворения (при необходимости немного подогревают), устанавливают pH 7,2 +/- 0,2 при 25 °С и автоклавируют при 115 °С в течение 15 мин. Простерилизованную горячую среду (70 - 80) °С быстро охлаждают до температуры 10 - 12 °С в холодной воде. Готовую среду хранят при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней.

11.3.1. Все реагенты наборов перед использованием необходимо прогреть при комнатной температуре в течение 30 мин., перед использованием содержимое флаконов необходимо аккуратно перемешать легким переворачиванием флакона. Пробирки с сенсибилизированными олигонуклеотидными ДНК-зондами извлекают из упаковки в количестве, соответствующем общему числу исследуемых и контрольных проб.

11.3.2. Перед началом работы необходимо проверить индикаторы уровня влажности: индикаторная полоска на пакетах с сорбентом должна иметь синий цвет, при высокой влажности она приобретает розовую окраску, что говорит о непригодности к использованию пробирок, находящихся в данном комплекте наборов.

11.3.3. Приготовление промывочного буфера: 1 флакон, содержащий 30 мл концентрированного (х20) промывочного буфера, вносят в 570 куб. см свежеприготовленной стерильной дистиллированной воды (или 1 объем концентрированного буфера на 19 объемов стерильной дистиллированной воды). Приготовление буфера рекомендуется проводить в мерном цилиндре: сначала количественно переносят содержимое флакона с концентрированным буфером, после чего постепенно по стенке цилиндра вливают дистиллированную воду, доводя общий объем до 600 куб. см, и тщательно перемешивают, избегая образования пены на поверхности смеси. Хранение готового буфера: 1 месяц при комнатной температуре.

Примечания.

- Содержимое гибридизационного буфера является едким веществом и не должно попадать в глаза и на кожу. В случае контакта немедленно обильно промыть и обратиться к врачу.

- При проведении анализа необходимо надеть защитную одежду и перчатки.

- Большинство реагентов содержат азид натрия в качестве консерванта.

11.4.1. Общие положения по отбору и подготовке проб

Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), ГОСТ Р 51921-2002 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes", МУК 4.2.1122-02 "Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах", ГОСТ 3622-68 "Молоко и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию" и ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа".

11.4.2. Кисло-молочные продукты и сыры тщательно измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и подвергают нейтрализации до pH 7,2 +/- 0,2 1N раствором NaOH. Топленое масло или молочный жир расплавляют при температуре 40 - 45 °С и перемешивают до получения однородной эмульсии, масло сливочное и мороженое расплавляют до сметанообразной консистенции.

11.5.1. Подготовленную в соответствии с разделом 5 пробу исследуемого продукта (гомогената) вносят в среду накопления - обогатительный бульон RM L по п. 4.2, предварительно прогретый в течение 15 мин. при температуре 45 °С, для первичного обогащения в соотношении 1:3 (25 г продукта в 75 куб. см среды). При необходимости анализа других масс продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:3 по объему. Пробы гомогенизируют с использованием гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых.

11.5.2. Гомогенизированную пробу в RM L бульоне термостатируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 6 ч.

11.5.3. Переносят 10 куб. см инкубированной в RM L бульоне пробы в 90 мл обогатительного бульона RM L, предварительно нагретого до температуры 41 °С. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 16 ч.

11.5.4. Маркируют пробирки, входящие в набор "Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes" в соответствии с номерами исследуемых проб и помещают в штатив для 12 мм пробирок с держателем. Не рекомендуется одновременно анализировать более 20 проб.

11.5.5. Внесение проб (после инкубации в течение 16 ч) и всех реагентов (лизирующего и гибридизационного буферов, конъюгата, субстрата) необходимо производить быстро и не касаясь наконечником краев пробирки. Не допускается использование одного наконечника для внесения разных проб или растворов буферов.

11.5.6. Проведение лизиса бактериальных клеток: в каждую промаркированную пробирку добавляют, строго соблюдая очередность, как изложено ниже, следующие компоненты набора:

11.5.6.1. Лизирующий буфер в количестве 100 мкл.

11.5.6.2. Исследуемую пробу в обогатительном бульоне RM L в количестве 100 мкл.

В качестве отрицательного контроля (ОК) используют стерильный бульон RM L - 100 мкл. Пробу стерильного бульона RM L, используемого в качестве отрицательного контроля, термостатируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 16 ч.

В качестве положительного контроля (ПК) используют тест-культуру Listeria monocytogenes, выращенную на бульоне RM L при 37 °С, также в количестве 100 мкл.

11.5.6.3. Пробирки закрывают адгезивной уплотнительной защитной пленкой (из набора), быстро перемешивают и помещают для инкубирования в водяную баню при температуре (37 +/- 1) °С на 15 мин.

11.5.7. Проведение гибридизации: вынимают штатив из водяной бани, удаляют защитную пленку и добавляют в каждую пробирку гибридизационный буфер по 250 мкл, закрывают пробирки новой защитной пленкой и интенсивно встряхивают. Пробирки с внесенным гибридизационным буфером инкубируют в водяной бане при температуре (50 +/- 1) °С в течение 60 мин.

11.5.8. Выявление гибридов:

11.5.8.1. Удаляют защитную пленку и быстро выливают содержимое всех пробирок одновременно, не вынимая их из штатива.

11.5.8.2. Не вынимая пробирки из штатива, быстро заполняют каждую пробирку промывочным буфером по п. 4.3.3 в количестве 5 куб. см, используя диспенсер, после чего быстро опустошают пробирки. Процедуру промывки проводят еще три раза. При проведении второй промывки также быстро полностью опустошают пробирки сразу после заполнения их промывочным буфером. Третий и четвертый раз промывают пробирки следующим образом: после заполнения пробирок промывочным буфером ждут 30 с перед тем, как полностью их опустошить.

Порядок заполнения пробирок промывочным буфером:

Первую и третью промывки начинают с первой пробирки, вторую и четвертую промывки - с последней пробирки.

После четвертой промывки содержимое пробирок энергично сливают в раковину, переворачивают штатив с пробирками и помещают на фильтровальную бумагу, слегка встряхивая до тех пор, пока пробирки не осушатся (4 - 5 раз), и оставляют их в перевернутом состоянии на несколько секунд.

11.5.8.3. Во все пробирки вносят раствор конъюгата по 100 мкл. Покрывают пробирки новой уплотняющей защитной пленкой и сильно встряхивают штатив. Инкубируют в водяной бане при (37 +/- 1) °С в течение 15 мин. Штатив вынимают из водяной бани, удаляют защитную пленку и быстро выливают содержимое всех пробирок одновременно, не вынимая их из штатива.

11.5.8.4. Пробирки промывают 4 раза, выдерживая каждый раз не менее 30 с (для этого быстро опустошают пробирки и затем полностью заполняют их промывочным буфером). Следует обратить внимание на то, что, промывая пробирки в четвертый раз, буфер необходимо вносить медленно, не допуская образования пены, а после его удаления на стенках пробирок не должно оставаться пены от промывочного буфера (пробирки должны быть абсолютно прозрачными).

По окончании промывки пробирки помещают на фильтровальную бумагу и оставляют в перевернутом состоянии несколько секунд, пока они полностью не осушатся.

11.5.8.5. Во все пробирки вносят раствор субстрата по 100 мкл и осторожно встряхивают. Инкубируют в темноте при температуре не выше 20 °С в течение 15 мин. Для внесения раствора субстрата следует пользоваться отдельной пипеткой для предотвращения его контаминации.

11.5.9. Измеряют уровень хемилюминесценции в каждой пробирке на люминометре "Люмлайт" или "Люмлайт мини" с интеграционным временем 5 с в соответствии с инструкцией к прибору.

Перед измерением каждую пробирку осторожно протирают для удаления капель жидкости. Следует обратить внимание, что во время измерения хемилюминесценции в пробирочном люминометре прибор не должен находиться под прямым источником света.

Примечания.

- Стадия гибридизации должна начинаться не позднее 45 мин. после стадии лизиса.

- Качество гибридизации и фиксации конъюгата зависит от времени и температуры инкубации, которые необходимо строго соблюдать.

- Низкий уровень pH (<5) в обогатительном бульоне после внесения высококислотных продуктов (фруктовые соки, кисло-молочные продукты и др.) может приводить к ложноотрицательным результатам; необходимо нейтрализовать пробы (раздел 5).

11.5.10. Учет результатов.

Результат прямого измерения хемилюминесценции в пробах выражают в относительных люминесцирующих единицах в секунду (ОЛЕ/с).

Определение пороговой величины измерения:

пороговая величина (отсекающее значение) определяется как уровень хемилюминесценции пробы с отрицательным контролем (ОК), умноженный на коэффициент 3 ("Cut-off" фактор).

11.5.10.1. Интерпретация полученных результатов: результат измерения считается положительным, если уровень хемилюминесценции в исследуемой пробе превышает уровень пороговой величины измерения (отсекающего значения).

Результат измерения считается отрицательным, если уровень хемилюминесценции в исследуемой пробе ниже или равен уровню пороговой величины измерения (отсекающего значения).

11.5.11. Результаты выявления Listeria monocytogenes в определенной навеске продукта записывают: "бактерии Listeria monocytogenes обнаружены в 25 г (куб. см) (в 50 - 100 г (куб. см) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта" или "бактерии Listeria monocytogenes не обнаружены в 25 г (куб. см) (в 50 - 100 г (куб. см) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта".

11.5.12. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.