"МУК 4.2.3434-17. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 22.02.2017)

1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Минздрава России (Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 февраля 2017 г.

4. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

Штамм Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 выделен из окультуренных почв методом многоступенчатой аналитической селекции, не является генетически модифицированным штаммом. Штамм предполагается использовать для производства биоудобрений в растениеводстве. Активность производственного штамма не менее 5 x 10⁶ кл./мл.

Культурально-морфологические особенности штамма: на среде Федорова штамм образует круглые, выпуклые, непрозрачные, бесцветные, слизистые колонии диаметром 2,0 - 4,0 мм, гладкие с ровным краем, тягучей консистенции. На агаризованной среде Бэрка - блестящие голубоватые колонии.

При микроскопировании через 18 ч при температуре 28 - 30 °C можно видеть мелкие подвижные палочковидные клетки 1,0 x 2,0 мкм, длина варьирует вплоть до кокковидной формы. В зрелой культуре через 48 ч роста наблюдаются мелкие укороченные палочки, в основном одиночно расположенные. Эндоспор не образует. Клетки подвижны, имеют перитрихиальные жгутики. Грамотрицательные, каталазоположительные, непротеолитические, но могут использовать нитрат, аммиак и аминокислоты как источники азота, а крахмал и маннит в качестве источников углеводов.

Штамм Beijerinckia flumimnsis Bf 2806 не является зоо- и фитопатогенным, не относится к микроорганизмам, патогенным для человека (СП 1.3.2322-08), депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12258.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 5 000 кл./м³.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Прямой метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест бактерий на агаризованную среду Федорова и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

При выполнении измерений концентрации клеток в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают требования, изложенные в следующих документах.

6.1. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322-08.

6.2. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения N 1 к СП 1.3.2322-08: СП 1.3.2518-09.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

Для приготовления агаризованной среды Федорова смешивают указанные компоненты (г/дм³): калий однозамещенный фосфорнокислый - 0,5 г, магний сернокислый - 0,3 г, натрий хлористый - 0,3 г, железо сернокислое - 0,005 г, марганец сернокислый - 0,005 г, аммоний молибденовокислый - 0,005 г, борная кислота - 0,005 г, кальций углекислый - 3,5 г, меласса - 30,0 г, агар-агар - 17,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1,0 дм³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Смесь нагревают до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 121 °C в течение 15 мин и охлаждают до 60 °C. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 14 дней, не более.

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (среда Федорова) расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2 - 8 °C не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 +/- 2) °C. Через 1 - 2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

К - концентрация Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 в воздухе, кл./м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

T - время аспирации, мин.

Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме.