"МУК 4.1.2991-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флудиоксонила в томатах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22.12.2012 N 2).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 марта 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 16.08.2011 N 01.0095.02.08.11.

Флудиоксонил - контактный фунгицид широкого спектра действия с продолжительной активностью. Высокоэффективен против снежной плесени, твердой головни, гельминтоспориозной и фузариозной корневых гнилей на зерновых злаках, а также ризоктониоза, склеротиниоза, серой гнили и альтернариоза на винограде, косточковых плодовых, овощных и декоративных культурах.

Применяется в России в качестве фунгицида для предпосевного протравливания семян зерновых культур, гороха, подсолнечника и сахарной свеклы, а также для обработки клубней картофеля перед закладкой на хранение с нормой расхода от 5 до 125 г д.в./га.

Настоящий документ устанавливает процедуру измерений массовой концентрации флудиоксонила в томатах в диапазоне 0,5 - 5,0 мг/кг методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Название действующего вещества по ИСО: флудиоксонил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-пиррол-3-карбонитрил.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 248,2.

Белое кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления: 199,8 °C. Давление паров при 25 °C: . Коэффициент распределения н-октанол/вода: . Растворимость (г/дм3) при 25 °C: ацетон - 190, этанол - 44, н-октанол - 20, толуол - 2,7, гексан - 0,008, вода - 0,0018.

Вещество стабильно при температуре до 70 °C и не гидролизуется в диапазоне pH от 5 до 9.

В условиях природного освещения флудиоксонил деградирует с периодом полуисчезновения 9 - 10 дней.

В биологически активных почвах в аэробных условиях флудиоксонил быстро разлагается или переходит в прочносвязанное состояние: .

MRL тефлутрина в томатах, установленный в странах ЕС, составляет 1,0 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на экстракции флудиоксонила из томатов ацетоном, очистке экстракта, содержащего флудиоксонил, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на концентрирующем патроне Диапак С8, с последующим измерением содержания фунгицида в очищенном экстракте на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием и обработкой хроматограмм методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается подбором колонки и состава подвижной фазы.

4.1. Средства измерений

4.2. Реактивы

4.3. Вспомогательные устройства, материалы

Примечание. Допускается применение средств измерений, вспомогательных устройств, материалов, реактивов иных производителей с аналогичными техническими и метрологическими характеристиками, приведенными в разделе 4.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019-2009 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

7.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу

Температура воздуха: (20 +/- 5) °C.

Атмосферное давление: 84 - 106 кПа.

Относительная влажность воздуха: не более 80%.

7.2. Условия хроматографического анализа

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (60:40, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 см3/мин.

Рабочая длина волны: 268 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мм3.

Время удерживания флудиоксонила: (7,02 +/- 0,2) мин.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Диапак С8.

8.1. Очистка органических растворителей

8.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом. Срок хранения - 1 неделя.

8.1.2. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 дм3 ацетона и ). Срок хранения - 1 неделя.

8.1.3. Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия

В коническую колбу вместимостью 250 см3 вносят навеску (50 +/- 2) г хлорида натрия, приливают 100 см3 деионизованной воды, перемешивают в течение 5 мин, полученный раствор фильтруют. Фильтрат является насыщенным раствором хлорида натрия. Срок годности раствора - 1 неделя.

8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 600 см3 ацетонитрила, вносят 400 см3 бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают хроматографическую колонку Kromasil 100-C18 подвижной фазой для ВЭЖХ, приготовленной по п. 8.2, при скорости подачи растворителя 0,5 см3/мин не менее 2 ч до установления стабильной базовой линии.

8.4. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С8 для очистки экстракта

Концентрирующий патрон Диапак С8 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 7 см3 ацетонитрила и 7 см3 смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему) со скоростью 5 см3/мин. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

8.5. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания флудиоксонила из концентрирующего патрона Диапак С8

При отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов Диапак С8 проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания флудиоксонила из патронов.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,28 см3 градуировочного раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/см3 (п. 8.6.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 40 °C, остаток растворяют в 3 см3 смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 8.4. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 2 - 3 капель в секунду. Патрон промывают 4 см3 смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему), элюат отбрасывают. Затем через патрон пропускают 10 см3 смеси ацетонитрил-вода (6:4, по объему), отбирая последовательно по 2 см3 элюата. Каждую фракцию упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухие остатки растворяют в 2 см3 подвижной фазы для ВЭЖХ, приготовленной по п. 8.2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. и растворы хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения флудиоксонила в каждой из фракций определяют объем смеси ацетонитрил-вода (6:4, по объему), необходимый для полного вымывания флудиоксонила из патрона.

8.6. Приготовление градуировочных растворов

8.6.1. Исходный градуировочный раствор флудиоксонила с массовой концентрацией 200 мкг/см3

В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают (0,010 +/- 0,0001) г флудиоксонила, растворяют в 30 - 40 см3 ацетонитрила, доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят при температуре не выше -18 °C в течение 3 мес.

8.6.2. Градуировочный раствор флудиоксонила с массовой концентрацией 10 мкг/см3 (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 5 см3 исходного градуировочного раствора флудиоксонила с концентрацией 200 мкг/см3 (п. 8.6.1), доводят объем до метки подвижной фазой для ВЭЖХ, приготовленной по п. 8.2. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

При оценке полноты извлечения флудиоксонила для внесения в образцы используют ацетонитрильные растворы вещества с концентрациями 10 и 50 мкг/см3.

Градуировочный раствор N 1 и ацетонитрильные растворы флудиоксонила хранят при температуре не выше -18 °C в течение месяца.

8.6.3. Градуировочные растворы флудиоксонила с массовой концентрацией (0,1 - 1,0) мкг/см3 (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают 1, 2, 5 и 10 см3 градуировочного раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/см3 (п. 8.6.2), доводят объем раствора до метки подвижной фазой для ВЭЖХ, тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией флудиоксонила 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см3 соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

8.7. Градуировка хроматографа

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ) от концентрации флудиоксонила в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 градуировочным растворам (п. 8.6.3).

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора (п. 8.6.3) и анализируют при условиях хроматографирования по п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r. По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерения по анализу одного из градуировочных растворов. Если значение площади отличается более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.1979 N 2051-79) и правилами, определенными ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие. Требования при заготовках и поставках".

Образцы томатов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более суток; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C. Перед проведением анализа плоды измельчают.

9.1. Экстракция и очистка

Навеску измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см3, добавляют 100 см3 ацетона и гомогенизируют 3 мин при 10000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена. Осадок на фильтре промывают 50 см3 ацетона. Экстракт и промывную жидкость, объединенные в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/25 его часть (эквивалентную 1 г образца) переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 20 см3 смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему) и раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 см3. В воронку вносят 10 см3 деионизованной воды и 10 см3 насыщенного раствора хлорида натрия и раствор перемешивают. К водному раствору приливают 30 см3 смеси гексан-диэтиловый эфир (4:1, по объему) и содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз верхний гексановый слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см3. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 см3 смеси гексан-диэтиловый эфир (4:1, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С8

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.1, растворяют в 3 см3 смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на концентрирующий патрон Диапак С8, подготовленный по п. 8.4. Промывают патрон 4 см3 смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему), элюат отбрасывают. Флудиоксонил элюируют с патрона 4 см3 смеси ацетонитрил-вода (6:4, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток экстракта томатов растворяют в 5 см3 подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовленной по п. 8.2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 10.

10.1. В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 9.1 - 9.2), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца томатов повторяют операции по пп. 9.1 - 9.2, 10.1.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "МультиХром для Window", версия 1.5x.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание флудиоксонила рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

X - содержание флудиоксонила в пробе, мг/кг:

- площадь пика образца, мВ;

- площадь пика стандарта, мВ;

A - концентрация стандартного раствора флудиоксонила, мкг/см3;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3:

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на концентрирующем патроне Диапак С8 и последующего хроматографического определения, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,5 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,5 мг/кг - предел обнаружения флудиоксонила в анализируемом объекте.

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал флудиоксонила, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют и анализируют в соответствии с данной методикой.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

14.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R)

, - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Талалакина Т.Н., Макеев А.М. (ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии" Россельхозакадемии).