"МУК 4.1.3003-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фенгексамида в ягодах (клубника, киви), томатах, огурцах, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22.12.2012 N 2).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 марта 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 16.08.2011 N 0100.15.08.11.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций фенгексамида в ягодах (клубнике, киви), томатах, огурцах, винограде, виноградном соке в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: фенгексамид.

Название действующего вещества по ИЮПАК: N-(2,6-Дихлор-4-гидроксифенил)-1-метилциклогексанкарбоксамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: 

Молекулярная масса: 302,22.

Порошок белого цвета со слабым характерным запахом. Температура плавления 153 °C. Плотность 1,34 г/см3 (20 °C). Давление паров (20 °C); (25 °C). Растворимость в органических растворителях при 20 °C (в г/дм3): ацетон - 160; ацетонитрил - 15; изопропанол - 91; толуол - 5,7; н-гексан - < 0,1. Растворимость в воде при 20 °C (в г/дм3): 0,022 (pH 3,9), 0,038 (pH 7). Коэффициент распределения н-октанол/вода . Гидролитически стабилен в течение 30 дней при pH 5, 7, 9 (25 °C).

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность для крыс - более 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность для крыс - более 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс - более 5057 мг/м3 (4 ч).

Область применения

Фенгексамид - фунгицид защитного действия класса гидроксианилидов, рекомендуемый для применения на винограде, ягодных, плодовых косточковых, цитрусовых, овощных культурах и др.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении фенгексамида с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения вещества из анализируемых образцов ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

3.3. Вспомогательные средства измерений, устройства и материалы

Примечание. Допускается использование других вспомогательных средств измерений и устройств аналогичного назначения и иных производителей, технические характеристики которых не уступают указанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших данную методику и подтвердивших экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения фенгексамида на ней.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Ацетон

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.1.2. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.3. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.4. Хлористый метилен и этилацетат

7.1.4.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.4.2. Очистка растворителей. Каждый растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

7.2.1. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 0,2% (0,2%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 500 см3 помещают 250 - 300 см3 бидистиллированной воды, вносят 1 см3 ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 500 см3 ацетонитрила, вносят 500 см3 0,2%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,8 см3/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов

7.4.1. Исходный раствор фенгексамида для градуировки (концентрация 250 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,025 г фенгексамида, растворяют в 50 - 70 см3 ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 3 месяцев.

Градуировочные растворы N 2 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Раствор N 1 фенгексамида для градуировки и внесения (концентрация 25 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10,0 см3 исходного раствора фенгексамида с концентрацией 250 мкг/см3 (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при 4 - 6 °C в течение 3 месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено".

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 5 фенгексамида для градуировки (концентрация 0,25 - 2,5 мкг/см3)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают по 1,0; 2,0; 4,0 и 10,0 см3 раствора N 1 фенгексамида с концентрацией 25 мкг/см3 (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией фенгексамида 0,25; 0,5; 1,0 и 2,5 мкг/см3 соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при 4 - 6 °C в течение месяца.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площадей пиков (мЕА·с) от концентрации фенгексамида в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

7.6. Приготовление смесей гексан-этилацетат для очистки экстрактов на колонке с силикагелем

7.6.1. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 80 см3 гексана и 20 см3 этилацетата, перемешивают.

7.6.2. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 70 см3 гексана и 30 см3 этилацетата, перемешивают.

7.7. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 см3 гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают смесью гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, затем 8:2, порциями по 30 см3, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

7.8. Проверка хроматографического поведения фенгексамида на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора N 1 фенгексамида с концентрацией 25 мкг/см3 (п. 7.4.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 5 см3 смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 40 - 60 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей порциями по 3 см3, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 25 см3 смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 70 см3 смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 см3) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см3 подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание фенгексамида по п. 9.3.

Фракции, содержащие фенгексамид, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения фенгексамида следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 6828-89 "Земляника свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации"; ГОСТ Р 53589-2009 "Киви, реализуемые в розничной торговле. Технические условия"; ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие. Технические условия"; ГОСТ Р 51810-2001 "Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети. Технические условия"; ГОСТ 1726-85 "Огурцы свежие. Технические условия"; 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия"; 28472-90 "Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках"; 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (от 21.08.1979 N 2051-79).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы ягод, томатов, огурцов, винограда измельчают.

9.1. Ягоды, томаты, огурцы, виноград

9.1.1. Экстракция

Образец измельченных проб массой 50 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 400 - 500 см3, добавляют 250 см3 ацетона, интенсивно встряхивают (или гомогенизируют) в течение 1 мин, затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента". Растительный остаток повторно экстрагируют 100 см3 ацетона при встряхивании в течение 30 мин, раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в колбу для упаривания на 500 см3 и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до водного остатка (объем 25 - 35 см3). Очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.1.2, затем на колонке с силикагелем по п. 9.1.3.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Водный остаток в колбе, полученный по пп. 9.1.1 или 9.2.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, колбу дополнительно обмывают 100 см3 деионизованной воды, которую также переносят в воронку, вносят 30 см3 насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Затем в воронку вносят 40 см3 дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в коническую колбу на 250 - 300 см3. Экстракцию фенгексамида повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 30 см3. Объединенный дихлорметановый экстракт фильтруют через слой (около 2 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусную воронку, в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 см3, упаривают досуха и дополнительно очищают на колонке с силикагелем по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Остаток, полученный по п. 9.1.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 5 см3 смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды смесью гексан-этилацетат (8:2, по объему) порциями по 3 см3, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 25 см3 смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, элюат отбрасывают.

Фенгексамид элюируют с колонки 50 см3 смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 см3, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C, остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы и анализируют содержание фенгексамида по п. 9.3.

9.2. Виноградный сок

9.2.1. Экстракция

Пробу сока массой 50 г помещают в коническую колбу на 250 - 300 см3, добавляют 100 см3 ацетона, интенсивно встряхивают (или гомогенизируют) в течение 1 мин, затем помещают на 30 мин в холодильник (4 - 6 °C).

Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента", фильтр с осадком дополнительно промывают 20 см3 ацетона. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в колбу для упаривания на 250 см3 и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до водного остатка (объем 25 - 35 см3). Очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.1.2, затем на колонке с силикагелем по п. 9.1.3.

9.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны.

Рабочие длины волн: 246 и 289 нм <*>.

--------------------------------

<*> Хроматографирование пробы при двух длинах волн повышает надежность идентификации.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Eclipse XDB C18, зернение 5 мкм.

Температура колонки: 25 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-0,2% ортофосфорная кислота (50:50, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 см3/мин.

Объем вводимой пробы: 20 мм3.

Ориентировочное время выхода фенгексамида: 11,210 - 11,425 мин.

Линейный диапазон детектирования 5 - 50 нг.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (мЕА·с), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию фенгексамида в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 2,5 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, не более чем в 50 раз.

Содержание фенгексамида в пробе (X мг/кг) рассчитывают по формуле:

C - концентрация фенгексамида, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см3;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

m - масса анализируемого образца, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание фенгексамида в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание фенгексамида в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см3.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация фенгексамида в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;

C - известная концентрация градуировочного раствора фенгексамида, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;

2,26 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 2,26%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов фенгексамида, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

, - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Ракитский В.Н., Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н., Мухина Л.П. (ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора).