"МУК 4.1.2990-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания пириметанила в воде, почве, картофеле, винограде, землянике, томатах, семечковых плодовых культурах, виноградном, томатном и яблочном соках методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)

1. Разработаны ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Россельхозакадемии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22.12.2012 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 марта 2012 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 29.09.2011 N 01.00225/205-69-11.

Область применения

Пириметанил - контактный фунгицид с местным системным эффектом, обладающий защитным и лечебным действием. Эффективен в борьбе с возбудителями серой гнили и парши на виноградниках, посадках семечковых и косточковых плодовых, овощных и декоративных культурах. Механизм его действия связан с ингибированием синтеза метионина, приводящего к подавлению секреции ферментов, необходимых для процесса заражения.

Проходит регистрационные испытания в Российской Федерации в качестве фунгицида в составе смесевого препарата на посадках картофеля, винограда, земляники, томатов открытого и защищенного грунта, в яблоневых и грушевых садах с нормой расхода от 150 до 450 г д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Метод основан на экстракции пириметанила из анализируемой пробы органическим растворителем, очистке экстрактов, содержащих пириметанил, от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем, с последующим измерением содержания пириметанила методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры с использованием термоионного детектора (ТИД) и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

--------------------------------

<*> Допускается применение средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов иных производителей с аналогичными техническими и метрологическими характеристиками, приведенными в разделе 4.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91, в наличии должны быть средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работающих правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения газохроматографического анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

7.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу

7.2. Условия хроматографического анализа

Перед проведением измерений проводят следующие операции: очистку органических растворителей, приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовку колонки с силикагелем, градуировку хроматографа.

8.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

Срок хранения - 1 неделя.

8.1.2. Очистка этилацетата

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%.

Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в (40 - 60) куб. см дистиллированной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

Капиллярную кварцевую колонку VF-5ms (типа SE-52) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 290 °C и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 ч.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 20 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля в 10 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают последовательно 15 куб. см ацетона и 10 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания пириметанила из колонки с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помешают 0,5 куб. см градуировочного раствора пириметанила в смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 8.5.2) и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 8.3. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1, со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 50 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C, сухие остатки растворяют в 2 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения пириметанила в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, необходимый для полного вымывания флуопирама из колонки.

8.5.1. Приготовление исходного градуировочного раствора пириметанила с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,0100 +/- 0,0001) г пириметанила, растворяют в (30 - 40) куб. см этилацетата, доводят объем раствора до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.

Раствор хранят при температуре не выше минус 18 °C не более 2 месяцев.

8.5.2. Приготовление градуировочного раствора пириметанила с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного градуировочного раствора пириметанила с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 8.5.1), разбавляют смесью гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2 до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5.

При оценке полноты извлечения пириметанила для внесения в образцы используют ацетоновые растворы вещества.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновые растворы пириметанила хранят при температуре не выше минус 18 °C в течение месяца.

8.5.3. Приготовление градуировочных растворов пириметанила с массовой концентрацией 0,2 - 2,0 мкг/куб. см (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 50 куб. см помещают 1, 2, 5 и 10 куб. см градуировочного раствора N 1 пириметанила с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 8.5.2), доводят до метки смесью гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией пириметанила 0,2, 0,4, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ) от массовой концентрации пириметанила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 8.5.3) и анализируют при условиях п. 7.2. Каждый раствор хроматографируют дважды. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где +/- дельта - границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 17.4.3.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. ТУ", ГОСТ 25892-83 "Сок виноградный. ТУ", ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки", ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие. Требования при заготовке, поставке и реализации", ГОСТ Р 51808-2001 "Картофель свежий продовольственный, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ", ГОСТ 7176-85 "Картофель свежий продовольственный, заготовляемый и поставляемый. ТУ", ГОСТ 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания. ТУ", ГОСТ 6014-68 "Картофель свежий для переработки. ТУ", ГОСТ 6828-89 "Земляника свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации".

Пробы воды анализируют в день отбора пробы или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре при температуре не ниже минус 18 °C не более 2 недель.

Пробы почвы подсушивают на воздухе в темноте, помещают в герметичную полиэтиленовую тару и хранят в холодильнике при температуре (4 - 6) °C не более 4 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не ниже минус 18 °C.

Пробы клубней, ягод и плодов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более суток; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C не более 6 месяцев. Пробы сока хранят при температуре (0 - 4) °C в герметичной упаковке не более недели, при температуре не выше минус 18 °C в течение 2 месяцев. Перед проведением анализа плоды, клубни и ягоды измельчают.

9.1.1. Экстракция пириметанила из проб воды

В делительную воронку вместимостью 500 куб. см помещают 200 куб. см отфильтрованной воды, добавляют 30 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2 и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз верхний органический слой отделяют и фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу. Водную фазу экстрагируют указанной выше смесью еще дважды порциями по 20 куб. см. Объединенную органическую фракцию упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание пириметанила по п. 10.

9.1.2. Экстракция пириметанила из проб почвы

Пробу воздушно-сухой почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон-вода с объемным соотношением компонентов 8:2, перемешивают. Колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Почву повторно экстрагируют 50 куб. см смеси ацетон-вода с объемным соотношением компонентов 8:2 в течение 30 мин. при встряхивании и фильтруют. Объединенный экстракт упаривают на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C до полного удаления ацетона. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.3. Экстракция пириметанила из клубней, плодов, ягод

Навеску измельченного растительного материала массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетона и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см ацетона. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/4 объема экстракта клубней картофеля (эквивалентного 5 г образца) или 1/20 объема экстрактов ягод винограда и земляники, плодов томата и яблок (эквивалентного 1 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и добавляют 30 куб. см дистиллированной воды. Растворы упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C до водной фазы (не менее 20 куб. см), которую переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.4. Экстракция из проб сока

Навеску (5 г) свежевыжатого сока помещают в химический стакан вместимостью 100 куб. см, приливают 100 куб. см дистиллированной воды, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/5 его часть (эквивалентную 1 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

К экстрактам, полученным по пп. 9.1.2, 9.1.3 и 9.1.4 и помещенным в делительные воронки, приливают по 20 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 20 и 10 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2. Объединенную органическую фракцию упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток экстракта почвы растворяют в 1 куб. см, томатного сока - в 2,5 куб. см, а виноградного и яблочного - в 12,5 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., анализируют на содержание пириметанила по п. 10. Сухие остатки экстрактов клубней картофеля, ягод и плодов подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 9.3 (При необходимости такой же очистке подвергаются и пробы почвы, содержащие мешающие определению коэкстрактивные вещества).

Сухие остатки экстрактов клубней картофеля, ягод и плодов, полученные по п. 9.2, растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1, помещая в ультразвуковую ванну на 2 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.3. Колбу обмывают 2 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1, которые также наносят на колонку. Колонку промывают 30 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Пириметанил элюируют с колонки 35 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток экстракта клубней картофеля растворяют в 1,25 куб. см, плодов томата - в 2,5 куб. см, ягод винограда, земляники, яблок - в 12,5 куб. см смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, помещая в ультразвуковую ванну на 2 мин., и анализируют на содержание пириметанила по п. 10.

Полнота извлечения пириметанила при проведении всех операций подготовки пробы не менее 94% для проб воды и не менее 88% для проб почвы, клубней картофеля, плодов, ягод и сока.

10.1. В инжектор хроматографа вводят 1 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 9.1 - 9.3), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждой пробы воды, почвы, клубней картофеля, ягод, плодов и сока повторяют операции по пп. 9.1 - 9.3, 10.1.

11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации "Galaxie", версия 1.9.3.2.

Альтернативная обработка результатов.

По градуировочной характеристике находят значение массовой концентрации пириметанила в экстрактах C, мкг/куб. см.

Массовую концентрацию пириметанила X, мг/куб. дм, в пробах воды рассчитывают по формуле:

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал пириметанила, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 2,0 мкг/куб. см, разбавляют, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой.

12.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

12.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 ("Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений"), используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Россельхозакадемии.