"МУК 4.1.2866-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Хлорантранилипрола в плодовых (косточковых) культурах, перце, огурцах, томатах, ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 28.09.2010 N 0050.27.09.10.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций Хлорантранилипрола в плодовых косточковых культурах, перце, огурцах, томатах, ягодах винограда и виноградном соке в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Структурная формула (не приводится).

Название действующего вещества по ИЮПАК: 3-Бром-N-[4-хлор-2-метил-6-(метилкарбамоил)фенил]-1-(3-хлорпиридин-2-ил)-1H-пиразол-5-карбоксамид.

Область применения: Хлорантранилипрол - инсектицид широкого спектра действия класса антранилдиамидов, эффективно подавляет развитие вредителей из отряда чешуекрылых, жесткокрылых (колорадский жук), двукрылых (минеры).

МДУ Хлорантранилипрола (в импортируемой продукции) в винограде, перце, плодовых (косточковых) - 1,0 мг/кг, томатах - 0,3 мг/кг, огурцах - 0,2 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Хлорантранилипрола с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения вещества из анализируемых образцов ацетонитрилом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших данную методику и подтвердивших экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с флорисилом, проверка хроматографического поведения Хлорантранилипрола на ней.

7.1.1. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.2. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3. Хлористый метилен и этилацетат

7.1.3.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.3.2. Очистка растворителей. Каждый растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2.1. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 0,2% (0,2%-ный раствор). В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 250 - 300 куб. м бидистиллированной воды, вносят 1 куб. см ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила, вносят 500 куб. см 0,2%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,8 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Исходный раствор Хлорантранилипрола для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г Хлорантранилипрола, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

Градуировочные растворы N 2 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Раствор N 1 Хлорантранилипрола для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора Хлорантранилипрола с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено".

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 5 Хлорантранилипрола для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10 куб. см раствора N 1 Хлорантранилипрола с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией Хлорантранилипрола 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более недели.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площадей пиков (мЕА х с) от концентрации Хлорантранилипрола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площади отличается более чем на 12% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

7.6.1. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 90 куб. см гексана и 10 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.6.2. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 80 куб. см гексана и 20 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.6.3. Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 70 куб. см гексана и 30 куб. см этилацетата, перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г флорисила в 30 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают смесью гексан - этилацетат в объемном соотношении 7:3, затем гексаном порциями по 30 куб. см, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 1 Хлорантранилипрола с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 40 - 60 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 50 куб. см гексана, смесями гексан - этилацетат в объемном соотношении 9:1, затем 8:2 порциями по 30 куб. см, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 50 куб. см смеси гексан - этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание Хлорантранилипрола по п. 9.3.

Фракции, содержащие Хлорантранилипрол, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения Хлорантранилипрола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами: 21920-76 "Слива и алыча крупноплодная свежие. ТУ"; 21833-76 "Персики свежие. ТУ"; 21921-76 "Вишня свежая. ТУ"; 21922-76 "Черешня свежая. ТУ"; 21832-76 "Абрикосы свежие. ТУ"; 21405-75 "Алыча мелкоплодная свежая. ТУ"; 1725-85 "Томаты свежие. ТУ"; Р 51810-2001 "Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети. ТУ"; 1726-85 "Огурцы свежие. ТУ"; 13908-68 "Перец сладкий свежий. ТУ"; 25896-83 "Виноград свежий столовый. ТУ", 28472-90 "Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках"; 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.1979 N 2051-1979).

Отобранные пробы плодов косточковых культур, огурцов, томатов, перца, винограда, сока хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Перед анализом образцы плодов косточковых культур, огурцов, томатов, перца, ягод винограда измельчают с помощью гомогенизатора.

9.1.1. Экстракция

Образец измельченных с помощью гомогенизатора плодов косточковых культур, огурцов, томатов, перца, ягод винограда массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 куб. см, вносят 20 куб. см бидистиллированной воды, помещают на аппарат для встряхивания на 20 мин. Добавляют 80 куб. см ацетонитрила, интенсивно встряхивают (или гомогенизируют) в течение 1 мин., затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента". Растительный остаток повторно экстрагируют 100 куб. см ацетонитрила при встряхивании в течение 30 мин., раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в колбу для упаривания на 500 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до объема 10 - 15 куб. см. Очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.1.2, затем на колонке с флорисилом по п. 9.1.3.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Водный остаток в колбе, полученный по п. п. 9.1.1 или 9.2.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, колбу дополнительно обмывают 40 куб. см воды, которую также переносят в воронку, вносят 20 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Затем в воронку вносят 30 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в коническую колбу на 250 - 300 куб. см. Экстракцию Хлорантранилипрола повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 30, затем 20 куб. см. Для обеспечения лучшего расслаивания проб раствор переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 5 мин. при 3000 об./мин. Объединенный дихлорметановый экстракт фильтруют через слой (около 2 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку, в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 куб. см, упаривают досуха и дополнительно очищают на колонке с флорисилом по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с флорисилом

Остаток, полученный по п. 9.1.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 3 куб. см смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды смесью гексан - этилацетат (9:1, по объему) порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 50 куб. см гексана, 30 куб. см смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 9:1, затем 30 куб. см смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 8:2, элюат отбрасывают.

Хлорантранилипрол элюируют с колонки 40 куб. см смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 7:3 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы и анализируют на содержание Хлорантранилипрола по п. 9.3.

9.2.1. Экстракция

Пробу сока массой 20 г помещают в коническую колбу на 250 - 300 куб. см, добавляют 20 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают, вносят 80 куб. см бидистиллированной воды, интенсивно встряхивают (или гомогенизируют) в течение 1 мин., затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин.

Пробу переносят в делительную воронку на 250 куб. см, после полного разделения слоев нижний водный слой собирают в колбу, в которой находилась проба, верхний переносят в колбу для упаривания на 500 куб. см, фильтруя через бумажный фильтр, помещенный в химическую воронку. В коническую колбу с пробой вносят новую порцию ацетонитрила объемом 100 куб. см и повторно экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Затем раствор переносят в делительную воронку на 250 куб. см, после полного разделения слоев нижний водный слой отбрасывают, верхний фильтруют через бумажный фильтр, помещенный в химическую воронку, и переносят в колбу для упаривания, объединяя с первой порцией экстракта.

Объединенный отфильтрованный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до объема 10 - 15 куб. см. Очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.1.2, затем на колонке с флорисилом по п. 9.1.3.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны.

Рабочие длины волн: 260 и 245 нм <*>.

--------------------------------

<*> Хроматографирование пробы при двух длинах волн повышает надежность идентификации.

Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Eclipse XDB С18, зернение 5 мкм.

Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,2%-ная ортофосфорная кислота (50:50, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода Хлорантранилипрола: 6,97 - 7,15 мин.

Линейный диапазон детектирования 2 - 20 нг.

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (в мЕА х с), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию Хлорантранилипрола в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, не более чем в 50 раз.

Содержание Хлорантранилипрола в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

С - концентрация Хлорантранилипрола, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание Хлорантранилипрола в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.