"МУК 4.1.2706-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств эмамектина (эмамектина бензоата) в воде, почве, капусте, томатах, ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

--------------------------------

<*> Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3.12.2009 N 3).

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации эмамектина бензоата (далее - эмамектина) в воде в диапазоне 0,0002 - 0,002 мг/куб. дм, почве, капусте, томатах, ягодах винограда и виноградном соке в диапазоне 0,005 - 0,05 мг/кг.

Область применения

Эмамектин - несистемный инсектицид кишечно-контактного действия для защиты томатов, виноградной лозы, капусты и других культур от широкого спектра личинок лепидоптеры.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0,005 мг/куб. дм; ОДУ в почве - 0,07 мг/кг, МДУ в капусте - 0,7 мг/кг, томатах - 0,02 мг/кг, винограде - 0,05 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении эмамектина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с флуоресцентным детектором после экстракции эмамектина из проб воды дихлорметаном, почвы - смесью ацетонитрил-вода (в объемном соотношении 9:1), капусты, томатов, ягод винограда и виноградного сока - ацетонитрилом, очистки аликвоты экстракта на концентрирующих патронах Oazis(R) HLB, превращения вещества во флуорогенное (N-трифторацетилированное) производное.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление раствора ортофосфорной кислоты, реактива для дериватизации, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Oazis(R) HLB.

7.1.1. Ацетонитрил

Растворитель кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Дихлорметан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой - до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 250 - 300 куб. м деионизованной воды, вносят 0,5 куб. см ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объемном соотношении 1:2. Реактив годен в течение рабочего дня.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 950 куб. см ацетонитрила и 50 куб. см 0,1%-ного (по объему) раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.4) при скорости подачи растворителя 1,3 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.6.1. Исходный раствор эмамектина для градуировки (концентрация 200 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,0200 г эмамектина, растворяют в 50 - 60 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре -18 °C в течение 6-ти месяцев.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.6.2. Раствор N 1 эмамектина для градуировки и внесения (концентрация 2 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного раствора эмамектина с концентрацией 200 мкг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре -18 °C в течение 6-ти месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб воды и почвы, капусты, томатов, винограда и сока с внесением эмамектина при оценке полноты извлечения вещества методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.6.3. Рабочие растворы N 2 - 5 эмамектина для градуировки (концентрация 0,01 - 0,1 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора N 1 с концентрацией 2 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией эмамектина 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см, соответственно.

Рабочие растворы сразу после приготовления помещают в морозильную камеру, где хранят при температуре -18 °C в течение 6-ти месяцев.

7.6.4. Рабочие растворы N 2а - 5а флуорогенного производного эмамектина для градуировки (соответствуют концентрации эмамектина 0,01 - 0,1 мкг/куб. см). В 4 градуированные пробирки вместимостью 10 куб. см вносят по 1 куб. см каждого из 4-х рабочих растворов эмамектина N 2 - 5 (п. 7.6.3), прибавляют по 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая пробирки с ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (приготовленного по п. 7.3), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку вносят по 0,6 куб. см деионизованной воды и 3 куб. см ацетонитрила, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2а - 5а флуорогенного производного с концентрацией эмамектина 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см, соответственно.

Рабочие растворы сразу после приготовления помещают в морозильную камеру, где хранят при температуре -18 °C в течение месяца.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (единицы LU x с) от концентрации эмамектина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам флуорогенного производного эмамектина N 2а - 5а для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 10 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площадей отличается более чем на 6% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

Патрон устанавливают на алонж с прямым отводом для вакуума и промывают с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом. Используют 1 куб. см метанола, затем 2 куб. см деионизированной воды со скоростью прохождения растворителей через патрон 1 - 2 капли в секунду. Патроны готовят непосредственно перед анализом.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", 1743.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", 26950-89 "Почвы. Отбор проб", 1725-85 "Капуста белокочанная. ТУ", 26768-85 "Капуста белокочанная свежая. ТУ", 1725-85 "Томаты свежие. ТУ", 25896-83 "Виноград свежий столовый. ТУ", 28472-90 "Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках", 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы воды анализируют в день отбора или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18 °C.

Образцы почвы подсушивают в темноте до постоянного веса, помещают в герметичную тару и хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре не более недели.

Пробы капусты, томатов, ягод винограда хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5-ти дней, виноградный сок анализируют в день приготовления.

Для длительного хранения образцы почвы, растительной продукции и сока замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом воду фильтруют через неплотный бумажный фильтр, почву просеивают через сито с диаметром отверстий 2 мм, капусту, томаты, виноград измельчают.

9.1.1. Экстракция

Образец анализируемой воды объемом 100 куб. см (W) помещают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще трижды порциями хлористого метилена по 30, 20 и 20 куб. см. Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) переносят в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха. Для полного удаления следов влаги в колбу вносят 3 - 5 куб. см ацетонитрила и вновь упаривают <*>. Остаток в колбе растворяют в 2 куб. см ацетонитрила (V), помещая в ультразвуковую баню на 2 мин. Аликвоту полученного раствора объемом 1 куб. см с помощью пипетки переносят в градуированную пробирку вместимостью 10 куб. см и подвергают дериватизации по п. 9.1.2.

--------------------------------

<*> Использование безводного сульфата натрия для осушения экстракта недопустимо, поскольку это ведет к полной потере вещества.

9.1.2. Дериватизация

К ацетонитрильному раствору, полученному по п. 9.1 или 9.2.2, прибавляют 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая пробирки в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (приготовленного по п. 7.3), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. По окончании процесса в пробирку вносят 0,6 куб. см деионизованной воды и 3 куб. см ацетонитрила, тщательно перемешивают и анализируют в условиях хроматографирования, указанных в п. 9.5.

9.2.1. Экстракция

Образец сухо-воздушной почвы массой 10 г (m) помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см смеси ацетонитрил-вода (9:1, по объему), гомогенизируют в течение 5 мин., затем помещают на механический встряхиватель на 15 мин. Пробе дают отстояться, затем переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 5 мин. при 3500 об./мин. Аликвоту надосадочной жидкости объемом 10 куб. см (1/5 часть экстракта) с помощью пипетки переносят в плоскодонную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 17 куб. см деионизованной воды, помещают на 2 мин. в ультразвуковую баню, затем подвергают очистке по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Oazis HLB

Пробу, полученную по п. 9.2.1 (почва), п. 9.3 (капуста, томаты, виноград) или 9.4 (виноградный сок), вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом на концентрирующий патрон Oazis HLB 3cc (60 mg), подготовленный по п. 7.8, со скоростью пропускания раствора 2 - 3 капли в секунду, не допуская пересыхания патрона. После нанесения пробы патрон промывают 2 куб. см смеси вода-ацетонитрил (7:3, по объему), пропуская растворитель до нижнего края сорбента, элюаты отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 2 куб. см ацетонитрила, собирая элюат непосредственно в круглодоннную колбу для упаривания вместимостью 20 - 25 куб. см (при сборе элюата в пробирку и последующем переносе раствора в колбу для упаривания, пробирку необходимо обмыть дважды порциями ацетонитрила по 2 - 3 куб. см). Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха. Для полного удаления следов влаги в колбу вносят 3 - 5 куб. см ацетонитрила и вновь упаривают. Остаток в колбе растворяют в 1 куб. см ацетонитрила (V), помещая в ультразвуковую баню на 2 мин. и подвергают дериватизации по п. 9.1.2.

Образец измельченной капусты, томатов или ягод винограда массой 10 г (m) помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют порцию ацетонитрила объемом 47 куб. см (капуста), 48 куб. см (томаты) или 45 куб. см (ягоды винограда), помещают на 3 мин. в ультразвуковую баню, затем 15 мин. встряхивают на механическом встряхивателе. Пробе дают отстояться, переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 5 мин. при 3500 об./мин. Аликвоту надосадочной жидкости объемом 10 куб. см (1/5 часть экстракта) с помощью пипетки переносят в плоскодонную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют порцию деионизованной воды объемом 18 куб. см (капуста), 19 куб. см (томаты), 17 куб. см (ягоды винограда), помещают на 2 мин. в ультразвуковую баню, подвергают очистке по п. 9.2.2, затем дериватизации по п. 9.1.2.

Образец виноградного сока массой 10 г (m) помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 40 куб. см ацетонитрила, помещают на 5 мин. в ультразвуковую баню, затем 15 мин. встряхивают на механическом встряхивателе. Пробу переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 5 мин. при 3500 об./мин. Аликвоту надосадочной жидкости объемом 10 куб. см (1/5 часть экстракта) с помощью пипетки переносят в плоскодонную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 15 куб. см деионизованной воды, помещают на 2 мин. в ультразвуковую баню, подвергают очистке по п. 9.2.2, затем дериватизации по п. 9.1.2.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Жидкостный хроматограф с флуоресцентным детектором с переменной длиной волны

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Eclipse XDB C18, зернение 5 мкм.

Температура колонки: 35 °C.

Объем вводимой пробы: 10 куб. мм.

Подвижная фаза: ацетонитрил-0,1% ортофосфорная кислота (95:5, по объему).

Скорость потока элюента: 1,3 куб. см/мин.

Ориентировочное время выхода:

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор флуорогенного производного эмамектина с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют ацетонитрилом (не более чем в 10 раз).

Содержание эмамектина в пробе (X, мг/куб. дм) рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе воды менее 0,0002 мг/куб. дм, почвы, капусты, томатов, ягод винограда и виноградного сока - менее 0,005 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,0002 мг/куб. дм и 0,005 мг/кг - пределы обнаружения в воде, почве, капусте, томатах, ягодах винограда и виноградном соке, соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.