"МУК 4.1.2773-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовых концентраций летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, изомасляная, масляная, валериановая, изокапроновая, капроновая) в биосредах (кровь) газохроматографическим методом. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 22.11.2010)

1. Разработаны Федеральным государственным учреждением науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 22 ноября 2010 г.

4. Введены впервые.

1.1. Методические указания по определению массовых концентраций летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, изомасляная, масляная, валериановая, изокапроновая, капроновая) в биосредах (кровь) предназначены для использования территориальными органами и подведомственными организациями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, осуществляющими деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

1.2. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием летучих жирных кислот в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания метрологически аттестованы (свидетельство N 223.1.11.11.98/2009.)

Уксусная кислота - бесцветная жидкость с характерным запахом.

Плотность уксусной кислоты (15 °C) 1,0553 г/куб. см. Обладает сильным раздражающим действием. Вызывает гипертрофические и атрофические фарингиты, ларингиты, а также конъюнктивиты и бронхиты [пункт 1 Приложения настоящих МУК] <*>.

--------------------------------

<*> Далее по тексту ссылка на номер пункта Приложения указывается одним номером в квадратных скобках.

1.9. Диапазон измерений массовых концентраций летучих жирных кислот приведен в табл. 1.

Методика обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2.

Методика основана на экстракции летучих жирных кислот из крови изобутиловым спиртом в кислой среде и последующем газохроматографическом анализе экстракта.

Выполнение измерений массовой концентрации летучих жирных кислот выполняют методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора.

Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 60 мин.

При подготовке проб крови и измерении концентраций летучих жирных кислот в анализируемом растворе применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.

5.1. При выполнении работ соблюдаются меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-91 [2], имеются средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83 [3] и соблюдаются правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79* 2001 [4].

5.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" (Утверждены МЗ СССР 20.12.82), М., 1981, и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (Утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87), М.: Недра, 1989.

5.3. При работе с реактивами следует соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 [5] и 12.1.005-88 [6]. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 [7].

5.5. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79* 2001 [4] и инструкции по эксплуатации прибора.

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

7.1. При приготовлении растворов и подготовке проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °C.

7.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.

Посуду для анализа замочить на 1 час в свежеприготовленном 3%-ном растворе двухромовокислого калия в серной кислоте (5,70 г двухромовокислого калия на 100 куб. см концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °C.

Хроматографическая капиллярная колонка протестирована на заводе-изготовителе: образец MN-Test температурный режим: колонка - от 80 °C до 320 °C при скорости нагрева колонки 8 °C/мин., детектор ионизации в пламени - 280 °C.

Колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии шумовых сигналов колонка готова к работе.

Для построения градуировочного графика готовят серию стандартных растворов. Для этого применяют стандартные образцы.

8.3.1. Исходный стандартный раствор летучих жирных кислот. В мерную пробирку вместимостью 10 куб. см вносят 3 куб. см изобутилового спирта, добавляют 15 куб. мм уксусной кислоты, по 10 куб. мм пропионовой, изомасляной, масляной кислот и по 5 куб. мм валериановой, изокапроновой и капроновой кислот. Раствор доводят до 5 куб. см изобутиловым спиртом, перемешивают. Концентрация компонентов в исходной стандартной смеси (с учетом плотности и содержания основного вещества) составляет для уксусной кислоты - 3120 мкг/куб. см, пропионовой - 1996 мкг/куб. см, изомасляной кислоты - 1916 мкг/куб. см, масляной кислоты - 1918 мкг/куб. см, валериановой кислоты - 930 мкг/куб. см, изокапроновой кислоты - 923 мкг/куб. см, капроновой кислоты - 923 мкг/куб. см. Срок хранения раствора 12 ч при комнатной температуре.

8.3.2. 1%-ный раствор серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 20 куб. см дистиллированной воды, добавляют 1 куб. см серной кислоты. Объем раствора в колбе доводят до метки после охлаждения дистиллированной водой, перемешивают.

8.3.3. 0,4%-ный раствор натрия гидроксида. В мерную колбу объемом 100 куб. см вносят 0,4 г натрия гидроксида и доводят до метки после охлаждения дистиллированной водой, перемешивают.

8.4.1. Приготовление градуировочных растворов для калибровки. Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной калибровки. По 5 стандартным смесям строят зависимость площади пика на хроматограмме (кв. мм) от концентрации кислоты (мкг/куб. см). Растворы готовят в мерных пробирках вместимостью 10 куб. см из исходного стандартного раствора, в соответствии с табл. 3 объем раствора в каждой пробирке доводят до 2 куб. см изобутиловым спиртом.

8.4.2. Приготовление рабочих растворов. Для построения градуировочного графика используют цельную кровь, не содержащую исследуемые компоненты. В пробирки со стандартными смесями, приготовленными по п. 8.4.1, добавляют по 2 куб. см крови, подкисляют 0,5 куб. см 1%-ного раствора серной кислоты до pH 2 - 3 (pH среды контролируется по индикаторной бумаге), экстрагируют 2 куб. см изобутилового спирта в течение 5 - 10 мин. Для отделения денатурированных белков экстракты центрифугируют при 6000 об./мин. в течение 10 мин., надосадочную жидкость переносят в бюкс. Прибавляют по 0,1 куб. см 0,4%-ного раствора щелочи (pH среды контролируется по индикаторной бумаге), растворы упаривают досуха при температуре 50 - 55 °C (экстракты упариваются под ИК-лампой). Добавляют 0,05 куб. см 1%-ного раствора серной кислоты, 0,1 куб. см изобутанола, перемешивают.

8.4.3. Хроматографирование растворов. В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях: температура термостата колонок 70 - 160 - 180 - 280 °C при скорости нагревания 10 - 5 - 25 °C/мин.; расход газа-носителя (азот) - 30 куб. см/мин.; деление потока 1:10.

Время удерживания:

- уксусной кислоты - 21 мин. (47 +/- 23) с;

- пропионовой кислоты - 23 мин. (47 +/- 23) с;

- изомасляной кислоты - 24 мин. (9 +/- 23) с;

- масляной кислоты - 25 мин. (43 +/- 23) с;

- валериановой кислоты - 29 мин. (46 +/- 23) с;

- изокапроновой кислоты - 32 мин. (22 +/- 23) с;

- капроновой кислоты - 34 мин. (29 +/- 23) с.

Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

8.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация летучих жирных кислот соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

где:

C - заданная концентрация кислоты в градуировочном растворе;

X - результат измерения массовой концентрации кислоты в градуировочном растворе.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

Отбор проб венозной крови объемом не менее 4 куб. см производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой. Анализ крови проводят в течение суток. Возможно хранение пробы крови в морозильной камере не более пяти дней.

Отбирают 2 куб. см крови и помещают в химически чистую центрифужную пробирку вместимостью 10 куб. см, добавляют 0,5 куб. см 1%-ного раствора серной кислоты до достижения pH 2 - 3 и экстрагируют 2 куб. см изобутанола в течение 10 мин. Экстракт центрифугируют при 6000 об./мин. в течение 10 мин., надосадочную жидкость переносят в бюкс, прибавляют 0,1 куб. см 0,4%-ного раствора щелочи. Раствор упаривают досуха, добавляют 0,05 куб. см 1%-ного раствора серной кислоты, 0,1 куб. см изобутанола и проводят количественное определение кислот в подготовленной пробе газохроматографическим методом. Для каждого образца делают по три ввода подготовленной пробы.

Условия выполнения измерений по п. 8.4.3.

10.1. Концентрацию анализируемых кислот в крови C, мкг/куб. см, рассчитывают по формуле:

A - количество компонента в объеме вводимой пробы, найденное по калибровочному графику, мкг;

B - объем крови, куб. см;

K - коэффициент пересчета, учитывающий степень экстракции кислот из крови. Коэффициент устанавливается в результате расчета отношения площадей хроматографических пиков, полученных при анализе стандартного образца до и после экстракции:

где r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

В случае, если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание уксусной кислоты в пробе менее 3,0 мкг/куб. см, где 3,0 мкг/куб. см - предел обнаружения".

При выполнении условия (4) приемлемы оба результата измерений и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 4.

Примечание. При представлении результата измерений в документах, выдаваемых лабораторией, указывают:

- количество результатов параллельных определений, использованных для расчета результата измерений;

- способ определения результата измерений (среднее арифметическое значение или медиана результатов параллельных определений).

Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 [8] и рекомендациями по межгосударственной стандартизации РМГ 76-2004 ГСИ [9].

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

При невыполнении условия (5) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (5) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Контрольные процедуры при контроле промежуточной прецизионности получают с использованием рабочих проб крови.

Значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 5.

1. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества. Справочник для химиков, инженеров и врачей/ Н.В. Лазарев, Э.Н. Левина. Издательство "Химия", 1976.

2. ГОСТ 12.1.004-91. Пожарная безопасность. Общие требования. Дата введения 01.07.92.

3. ГОСТ 12.4.009-83. Пожарная техника для защиты объектов. Межгосударственный стандарт. Дата введения 01.01.1985.

4. ГОСТ 12.1.019-79* 2001. Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты. Дата введения 01.07.1980.

5. ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. Дата введения 1977-01-01.

6. ГОСТ 12.1.005-88. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны. Дата введения 01.01.1989.

7. СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами третьей, четвертой групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней.

8. ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

9. РМГ 76-2004 "ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".