"МУК 4.1.2175-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Цимоксанила в томатах, винограде, зеленой массе, семенах и масле подсолнечника методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2007)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в томатах, винограде, зеленой массе, семенах и масле подсолнечника массовой концентрации Цимоксанила в диапазоне 0,1 - 1,0 мг/кг.

Цимоксанил - действующее вещество препарата Танос, ВДГ 250 + 250 г/кг (Цимоксанил + Фамоксадон), фирма-производитель: Дюпон, США.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 1-(2-циано-2-метоксииминоацетил)-3-этилмочевина.

Молекулярная масса: 198,2.

Агрегатное состояние: кристаллическое вещество.

Цвет, запах: бесцветное вещество, без запаха.

Температура плавления: 160 - 161 °С.

Летучесть (давление паров): 0,15 мПа (при 20 °С).

Растворимость в воде при 20 °С (pH 5): 890 мг/кг; в органических растворителях при 20 °С: гексане - 0,037; толуоле - 5,29; ацетонитриле - 57; этилацетате - 28; н-октаноле - 1,43; метаноле - 22,9; ацетоне - 62,4; хлороформе - 103; дихлорметане - 133,0 г/куб. дм.

В почве Цимоксанил быстро разрушается под действием микроорганизмов. В тепличных условиях период полураспада составляет около трех дней, в полевых условиях от 7 до 14 дней. Миграция по почвенному профилю слабая.

В растениях соединение быстро разрушается до нетоксичных метаболитов. Остатки Цимоксанила в клубнях картофеля не обнаруживаются. В ягодах винограда, по данным фирмы Дюпон, остатки составляли ниже 0,2 мг/кг при обработке за несколько дней до уборки.

Краткая гигиеническая характеристика:

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,02 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,04 мг/кг;

ПДК в воде - 0,03 (органолептический) мг/куб. дм;

МДУ в картофеле и огурцах - 0,05;

ВМДУ в винограде - 0,1 мг/кг.

Область применения:

Цимоксанил - контактный фунгицид с местным системным эффектом, обладающий защитным и лечащим действием. Высокоактивен против грибов, вызывающих фитофтороз и пероноспороз, не действует на возбудителей настоящей мучнистой росы. Длительность защитного действия составляет 4 - 6 дней, поэтому рекомендуется его использование в смеси с другими фунгицидами системного и защитного контактного действия.

Зарегистрирован в России фирмой Дюпон под названием Танос (DPX - КР 481), ВДГ, 50% (25% Фамоксадона + 25% Цимоксанила) на картофеле с нормой расхода 0,6 кг/га, трехкратная обработка за сезон. Проходит регистрационные испытания на томатах, винограде и подсолнечнике.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на извлечении Цимоксанила из томатов, винограда, зеленой массы и семян подсолнечника подкисленным ацетонитрилом, переэкстракции в хлористый метилен, очистке полученного экстракта от мешающих анализу веществ на колонке с Флоризилом, патронах Диапак С16 и окончательном определении Цимоксанила методом ГЖХ с использованием термоионного детектора.

Масло подсолнечника разводят гексаном, проводят переэкстракцию в ацетонитрил и далее проводят очистку проб по общей схеме.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен и может применяться для определения остатков Цимоксанила в присутствии других пестицидов. Избирательность метода достигается за счет подбора колонки и условий программирования.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е.

Весы лабораторные технические ВЛТК-500, ГОСТ 7328.

Колбы мерные вместимостью 10, 50 и 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц Гамильтон вместимостью 10 куб. мм.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аналитический стандарт Цимоксанила с содержанием 99,7% д.в. (фирма Дюпон).

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Гелий очищенный марки "А", ТУ-51-940-80.

Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Этилацетат, х.ч., ГОСТ 22300-76.

Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 - 80 меш, фирма "Мерк".

Хлористый метилен, х.ч., ГОСТ 19433-88.

Стандартный раствор Цимоксанила в ацетоне - 1 мг/куб. см (хранить в холодильнике, срок годности 120 суток).

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Аппарат для встряхивания проб АВУ-1, ТУ 64-1-1081-73.

Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Воронки химические для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Цилиндры мерные НР.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480.

Концентраторы грушевидные на 100 и 250 куб. см, НШ 29 КГУ - 100 (250), ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5, длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирма J&W Scientific.

Насос вакуумный диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ 6-09-2678-77.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К подготовке проб допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7.1.1. Подготовка колонки, заполненной Флоризилом, для очистки проб томатов, винограда, зеленой массы, семян и масла подсолнечника

На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 10 см, диаметр 1,5 см) помещают пробку из стекловаты и заполняют колонку Флоризилом на высоту 5 см. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 см. За день до очистки экстракта колонку промывают последовательно 20 куб. см этилацетата и 10 куб. см гексана. Смывы отбрасывают. После промывки колонка готова к работе.

7.1.2. Проверка хроматографического поведения Цимоксанила на колонках с Флоризилом

При отработке методики или поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения Цимоксанила на колонке. В концентратор помещают 1 куб. см стандартного раствора Цимоксанила в ацетоне с концентрацией 10 мкг/куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе. Далее растворяют стандарт в 1 куб. см этилацетата, добавляют 4 куб. см гексана, перемешивают содержимое концентратора и наносят на колонку.

Промывают колонку 10 куб. см смеси гексан:этилацетат - 4:1, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 10 куб. см смеси гексан:этилацетат - 1:1, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 20 куб. см смеси гексан:этилацетат - 1:4, отбирая последовательно по 5 куб. см элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха.

Сухой остаток в концентраторах растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм. По результатам обнаружения Цимоксанила в каждой фракции определяют объем смеси гексан:этилацетат - 1:4, необходимый для полного вымывания Цимоксанила.

7.1.3. Подготовка патронов Диапак С16 для очистки проб винограда, зеленой массы, семян и масла подсолнечника

Патрон устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см, который используют как емкость для элюента. Патрон промывают последовательно 10 куб. см ацетонитрила и 10 куб. см дистиллированной воды. Промывку проводят под вакуумом непосредственно перед очисткой экстрактов образцов со скоростью не более 2 куб. см/мин., не допуская высыхания поверхности патрона.

7.1.4. Проверка хроматографического поведения Цимоксанила на патронах Диапак С16

В концентратор помещают 1 куб. см стандартного раствора Цимоксанила в ацетоне с концентрацией 10 мкг/куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе. Далее растворяют стандарт в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют в концентратор 10 куб. см дистиллированной воды, перемешивают содержимое и наносят на патрон. Смыв отбрасывают. Пропускают через патрон 20 куб. см смеси ацетонитрил:вода - 1:4, отбирая последовательно по 5 куб. см элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха.

Сухой остаток в концентраторах растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм. По результатам обнаружения Цимоксанила в каждой фракции определяют объем смеси ацетонитрил:вода - 1:4, необходимый для полного вымывания Цимоксанила.

7.2.1. Приготовление 2%-ного раствора сульфата натрия

2 г сульфата натрия вносят в мерную колбу на 1 куб. дм, добавляют 600 - 700 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения соли и доводят водой до метки.

7.2.2. Приготовление подкисленного ацетонитрила

В емкость, содержащую 1 куб. дм ацетонитрила, добавляют 10 куб. см 1 н хлороводородной кислоты и перемешивают содержимое.

50 мг Цимоксанила (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/куб. см). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Методом последовательного разбавления исходного раствора N 1 ацетоном готовят рабочие растворы Цимоксанила с концентрацией 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 мкг/куб. см, которые могут храниться в холодильнике не более 30 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Цимоксанила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 мкг/куб. см. В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Цимоксанила в растворе в мкг/куб. см (рисунок 1 - не приводится).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие. ТУ", ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий. ТУ", ГОСТ 22391-89 "Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках", ГОСТ 1129-93 "Масло подсолнечника. ТУ", ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы томатов, винограда и зеленой массы подсолнечника хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С.

Пробы семян подсолнечника подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов, не более 6 месяцев. Влажные семена замораживают и хранят в морозильной камере при -18 °С до 1 года.

Пробы масла подсолнечника хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 10 суток.

9.1.1. Томаты, виноград, зеленая масса и семена подсолнечника

Навеску 20 г (для зеленой массы и семян подсолнечника - 10 г) помещают в полипропиленовые банки объемом 250 куб. см, заливают 50 куб. см подкисленного ацетонитрила и встряхивают в течение 30 мин. По окончании встряхивания экстракт фильтруют в делительную воронку емкостью 250 куб. см через стеклянную воронку с бумажным фильтром. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и встряхивая смесь в течение 15 мин. Экстракты отфильтровывают в ту же делительную воронку.

Добавляют в делительную воронку 30 куб. см гексана и встряхивают содержимое в течение 1 - 2 минут. После разделения фаз нижнюю ацетонитрильную фазу сливают в стаканчик, гексан отбрасывают. Переносят экстракт из стаканчика в делительную воронку и промывают его еще раз 30 куб. см гексана, Ацетонитрильную фазу помещают в концентратор емкостью 250 куб. см, добавляют в концентратор 20 куб. см дистиллированной воды и выпаривают до водного остатка при температуре не выше 40 °С.

Водный остаток из концентратора переносят в делительную воронку емкостью 250 куб. см. Концентратор обмывают двумя порциями по 40 куб. см 2%-ного раствора сульфата натрия, смывы сливают в делительную воронку. Добавляют в делительную воронку 50 куб. см хлористого метилена и встряхивают содержимое воронки в течение 1 - 2 минут. После расслоения фаз нижний слой хлористого метилена сливают через воронку с безводным сульфатом натрия в концентратор емкостью 250 куб. см. Повторяют переэкстракцию еще два раза, используя каждый раз по 30 куб. см хлористого метилена. Хлористый метилен выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С.

9.1.1.1. Очистка экстракта на колонке с Флоризилом

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 куб. см этилацетата, добавляют 4 куб. см гексана, тщательно обмывают концентратор и наносят содержимое концентратора на колонку с Флоризилом, подготовленную, как указано в разделе 7.1.1. Промывают колонку 10 куб. см смеси гексан:этилацетат - 4:1, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 10 куб. см смеси гексан:этилацетат - 1:1, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 20 куб. см смеси гексан:этилацетат - 1:4, собирая элюат в концентратор емкостью 100 куб. см. Содержимое концентратора выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм.

Пробы винограда, зеленой массы, семян и масла подсолнечника дополнительно очищают на патронах Диапак С16.

9.1.1.2. Очистка экстракта на патроне Диапак С16

Сухой остаток в концентраторе разводят в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 10 куб. см дистиллированной воды, перемешивают содержимое, обмывая стенки концентратора, и наносят на патрон.

Пропускают 15 куб. см смеси ацетонитрил:вода - 1:4, смыв собирают в концентратор и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм.

9.1.2. Масло подсолнечника

Навеску масла 10 г помещают в стеклянный стаканчик емкостью 100 куб. см и разводят в 40 куб. см гексана. Содержимое стаканчика перемешивают и переносят в делительную воронку емкостью 250 куб. см. Добавляют в воронку 50 куб. см подкисленного ацетонитрила и встряхивают 2 минуты. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в коническую колбу, а верхний слой оставляют в делительной воронке, приливают туда 50 куб. см ацетонитрила и встряхивают 2 минуты. Ацетонитрильный экстракт сливают в ту же колбу. Экстракцию повторяют еще раз тем же объемом новой порции ацетонитрила.

Объединенный ацетонитрильный экстракт переносят в чистую сухую делительную воронку, добавляют туда 30 куб. см гексана и промывают ацетонитрил, встряхивая воронку 1 - 2 минуты. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в стаканчик, а гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще раз 30 куб. см гексана. После разделения фаз ацетонитрил сливают в концентратор емкостью 250 куб. см, добавляют туда 20 куб. см дистиллированной воды и выпаривают содержимое концентратора до водного остатка при температуре не выше 40 °С.

Далее проводят переэкстракцию Цимоксанила в хлористый метилен и очистку пробы на колонках с Флоризилом и патронах Диапак С16, как указано в разделах 9.1.1, 9.1.1.1 и 9.1.1.2.

Капиллярная кварцевая колонка НР-5 (95% метил-силикон + 5% фенил-пропил-силикон), длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 100 °С, нагрев колонки по 10 °С в минуту до 160 °С; затем нагрев колонки по 25 °С в минуту до 200 °С, выдержка 5 мин.

Продувка детектора и испарителя после анализа азотом - по 65 куб. см/мин. в течение 3 минут. Нагрев колонки до 280 °С.

Температура испарителя - 200 °С, детектора - 380 °С.

Регулятор расхода гелия - РРГ-11; режим - нормальный.

Газ 1 - гелий, линейная скорость - 30 см/сек., давление на входе - 35,27 кПа.

Газ 2 - гелий (продувка испарителя), расход - 0,5 куб. см/мин.; сброс 1:10.

Газ 3 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 40 куб. см/мин.

Расход водорода - 16 куб. см/мин.; воздуха - 200 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания Цимоксанила - 6 мин. 07 сек. - 6 мин. 12 сек.

Объем вводимой пробы - 1 куб. мм.

Минимально детектируемое количество Цимоксанила в анализируемом объеме - 1,0 нг.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 1,0 - 10,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией Цимоксанила 10,0 мкг/куб. см соответственно, разбавляют.

Количественное определение Цимоксанила проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов Цимоксанила с концентрацией 1,0 - 10,0 мкг/куб. см.

В качестве альтернативного варианта возможно использование газового хроматографа НР6890 Series GC System, NPD (азотно-фосфорный детектор) с капиллярной кварцевой колонкой НР-1 Methyl Siloxane. Длина колонки - 30 м, внутренний диаметр - 0,25 мм, толщина пленки - 0,25 мкм.

Температура детектора - 320 °С, температура испарителя - 200 °С. Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 100 °С (выдержка 1 минута) нагрев колонки по 10 градусов в минуту до 250 °С.

Газовый режим Split, газ-носитель - гелий; давление 23,78 psi, деление потока - 30:1, split поток - 59,7 куб. см/мин. Поток через колонку 2,0 куб. см/мин., средняя скорость - 44 см/сек. Расход водорода - 3,0 куб. см/мин., воздуха - 60 куб. см/мин., смешение 50 рА.

Для определения содержания Цимоксанила в пробах методом ГЖХ используют следующую формулу:

где:

Х - содержание Цимоксанила в пробе, мг/кг;

Sст - площадь пика стандарта, мВ;

Sпр - площадь пика образца, мВ;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

Р - содержание Цимоксанила в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".