"МУК 4.1.2462-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в томатах и луке-репке методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.

4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации диметоморфа в томатах и луке-репке в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

(E,Z)-4-[3(4-(хлорфенил)-3-(3,4-диметоксифенил)акрилоил]морфолин (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Область применения препарата

Диметоморф - системный фунгицид для борьбы с заболеваниями, вызываемыми оомицетами, особенно с возбудителями милдью винограда и фитофтороза картофеля и томатов.

МДУ в томатах и луке-репке 0,1 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с детектором электронного захвата ионов после экстракции из анализируемых проб томатов и лука-репки - ацетоном, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы: 0,25 нг.

В предлагаемых условиях метод специфичен.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, раствора внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.

7.1.2. н-Гексан. Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Метилен хлористый. Растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 25 г хлористого натрия, растворяют в 300 - 350 куб. см дистиллированной воды, доводя водой до метки, тщательно перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 800 куб. см гексана и 200 куб. см ацетона, тщательно перемешивают.

7.4.1. Исходный раствор диметоморфа для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г диметоморфа, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетона, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике (4 - 6 °С) в темноте в течение месяца.

Рабочие градуировочные растворы диметоморфа готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Раствор N 1 диметоморфа для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора диметоморфа с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетоном до метки. Раствор хранится в холодильнике в темноте в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения диметоморфа из исследуемых образцов методом "внесено-найдено".

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 5 для градуировки (концентрация 0,25 - 2,5 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 2,5; 5,0; 10,0 и 25,0 куб. см раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 4.2), доводят до метки смесью гексан-ацетон (8:2, по объему), приготовленной по п. 7.3, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией диметоморфа 0,25; 0,5; 1,0 и 2,5 мкг/куб. см соответственно. Растворы хранятся в холодильнике (в темноте) в течение 10 дней.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей хроматографических пиков (E)- и (Z)-изомеров (мВ х с) от концентрации диметоморфа в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.

В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см, внутренним диаметром 13 - 15 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию: 5 г флорисила (предварительно дезактивированного 4% по массе деионизованной воды) в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 1 для градуировки с концентрацией диметоморфа 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха. Остаток растворяют в 5 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу ополаскивают 3 куб. см этой же смеси, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 160 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), первые 50 куб. см элюата отбрасывают.

Далее элюат отбирают фракционно (по 10 куб. см), упаривают, остатки растворяют в 4 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие диметоморф, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения вещества следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие, ТУ", ГОСТ 1723-86 "Лук репчатый, ТУ", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы томатов и лука-репки хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Образец измельченных томатов или лука-репки массой 50 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 100 куб. см ацетона, гомогенизируют в течение 2 мин. Экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр, декантируя в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой. Экстракцию пробы повторяют новой порцией ацетона объемом 80 куб. см, встряхивая 2 мин. и фильтруя в мерный цилиндр. Остаток на фильтре промывают 20 куб. см ацетона.

Доводят общий объем раствора в цилиндре до 250 куб. см ацетоном, перемешивают. Аликвоту раствора объемом 100 куб. см (соответствующую 20 г анализируемого образца) подвергают очистке по п. 9.2.

Аликвоту ацетонового экстракта, полученную по п. 9.1.1 или 9.1.2, переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см. Вносят в воронку 50 куб. см дихлорметана, 20 куб. см 5%-ного водного раствора хлористого натрия и 200 мл деионизованной воды, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой фильтруют через безводный сульфат натрия (20 г), помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в колбу для упаривания вместимостью 500 куб. см. Операцию промывки встряхиванием в течение 1 мин. с дихлорметаном повторяют еще 2 раза порциями по 30 куб. см. Нижнюю органическую фазу каждый раз фильтруют через безводный сульфат натрия в ту же круглодонную колбу. Фильтр с сульфатом натрия промывают 20 куб. см дихлорметана. Объединенную органическую фазу упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 5 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают 3 куб. см смеси, которую также наносят на колонку. Промывают колонку со скоростью 1 - 2 капли в секунду 160 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), первые 50 куб. см элюата отбрасывают.

Последующие 110 куб. см элюата собирают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 40 °С, остаток в колбе растворяют в 4 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), анализируют содержание диметоморфа по п. 9.4.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Газовый хроматограф "Кристалл-2000М", снабженный детектором электронного захвата ионов

Колонка капиллярная НР-50 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм

Температура детектора: 320 °С

Температура испарителя: 300 °С

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 130 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 25 °С/мин. до температуры 280 °С, выдержка - 5 мин., нагрев колонки со скоростью 50 °С/мин. до температуры 300 °С, выдержка - 10 мин.

Скорость газа 1 (азот): 30 см/с, давление 11,399 кПа, поток 4,0547 куб. см/мин.

Газ 2: деление потока 1: 2,017; сброс 8,179 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем: 1 мм

Ориентировочное время выхода диметоморфа: (Z)-изомер - 17 мин. 59 с, (E)-изомер - 18 мин. 41 с

Линейный диапазон детектирования 0,25 - 2,5 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор диметоморфа с концентрацией 2,5 мкг/куб. см, разбавляют смесью гексан-ацетон (8:2, по объему) не более чем в 50 раз.

Содержание диметоморфа в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где:

С - концентрация диметоморфа, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков (E)- и (Z)-изомеров, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

К = 2,5 (с учетом объема экстракта, взятого для анализа).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание диметоморфа в пробе менее 0,05 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора.