"МУК 4.1.1624-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Фотометрическое измерение массовых концентраций бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Минздравом России 29.06.2003)

1. Методические указания подготовлены творческим коллективом специалистов Научно-исследовательского института медицины труда РАМН (Л.Г. Макеева - руководитель, Г.В. Муравьева, Е.М. Малинина, Е.Н. Грицун, Г.Ф. Громова) при участии А. И. Кучеренко (Департамент Госсанэпиднадзора Минздрава России).

2. Рекомендованы к утверждению на совместном заседании группы Главного эксперта Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию по проблеме "Лабораторно-инструментальное дело и метрологическое обеспечение" и методбюро п/секции "Промышленно-санитарная химия" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены труда и профпатологии".

3. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации.

4. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 29.06.03.

5. Введены впервые.

Методические указания "Измерение концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (выпуск 42) разработаны с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций вредных веществ их предельно допустимым концентрациям (ПДК) и ориентировочным безопасным уровням воздействия (ОБУВ) и являются обязательными при осуществлении санитарного контроля.

Включенные в данный сборник 29 методик контроля вредных веществ в воздухе рабочей зоны разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 ССБТ "Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования", ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений", МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа", МИ 2336-95 "Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритмы оценивания".

Методики выполнены с использованием современных методов исследования, метрологически аттестованы и дают возможность контролировать концентрации химических веществ на уровне и ниже их ПДК и ОБУВ в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах - ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны", ГН 2.2.5.1314-03 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны" и дополнениях N 1 к ним.

Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств.

Настоящие Методические указания устанавливают количественный фотометрический анализ воздуха рабочей зоны на содержание бета-глюканазы в диапазоне массовых концентраций 1,0 - 6,0 мг/куб. м.

2.1. Общая характеристика вещества.

Бета-глюканазу получают путем микробиологического синтеза с использованием штамм-продуцента Trichoderma longibrachiatum TW-1.

2.2. Физико-химические свойства.

Бета-глюканаза представляет собой однородный порошок светло-серого цвета; хорошо растворима в воде.

Ферментативная активность бета-глюканазы - 2000 ЕД/г.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.3. Токсикологическая характеристика.

Бета-глюканаза не обладает раздражающим действием на кожу и слизистые оболочки глаз, не проникает через неповрежденную кожу в количествах, вызывающих признаки интоксикации. Бета-глюканаза слабо кумулирует в организме при повторном введении в желудок. Сенсибилизирующее действие бета-глюканазы не обнаружено.

Ориентировочно безопасный уровень (ОБУВ) в воздухе рабочей зоны - 2 мг/куб. м.

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций бета-глюканазы с погрешностью, не превышающей +/- 24%, при доверительной вероятности 0,95.

Измерение массовой концентрации бета-глюканазы выполняется методом фотометрии.

Метод основан на способности бета-глюканазы, при ее действии на 1,3/1,4 бета-глюкан, образовывать восстанавливающие сахара. Измерение концентрации восстанавливающих сахаров проводят при длине волны 670 нм.

За единицу активности (ЕД) принята способность бета-глюканазы в стандартных условиях (50 °С, рН 6,5) катализировать гидролиз бета-глюкана с образованием восстанавливающих сахаров в количестве, эквивалентном 1 мкМ глюкозы в 1 мин.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания бета-глюканазы в анализируемой пробе (0,1 куб. см) - 5,0 мкг.

Нижний предел измерения концентрации бета-глюканазы в воздухе при отборе 500 куб. дм - 1,0 мг/куб. м.

Определению не мешает наличие в воздухе ксиланазы, фитолиазы, альфа-амилазы.

Примечание. Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели точности, установленные для данной методики выполнения измерений (МВИ).

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

6.3. При выполнении измерений с использованием фотоэлектроколориметра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Работа на фотоэлектроколориметре должна проводиться в чистом помещении, свободном от пыли, паров кислот и щелочей. Вблизи фотоэлектроколориметра не должны располагаться громоздкие изделия, создающие неудобства в работе оператора (ГОСТ 15150-69).

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим и средним специальным образованием, имеющие навыки работы на фотоэлектроколориметре.

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и влажности воздуха не более 80%.

8.2. Измерения на фотоэлектроколориметре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1.1. Приготовление стандартного раствора бета-глюканазы, 2 г/куб. дм

В коническую колбу вместимостью 500 куб. см наливают 200 - 250 куб. см дистиллированной воды и ставят ее на магнитную мешалку. Затем аккуратно вносят 1,00 г бета-глюканазы. Перемешивание продолжают в течение 15 мин. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин. при 7000 об./мин.

Раствор готовят в день проведения анализа.

Раствор используют в течение суток.

9.1.2. Приготовление раствора бета-глюкана (субстрат), 5 мг/куб. см

В коническую колбу вместимостью 100 куб. см наливают около 70 куб. см фосфатного буферного раствора (рН 6,5) при перемешивании его на магнитной мешалке, вносят 0,5 г бета-глюкана и продолжают перемешивать в течение 20 мин. при комнатной температуре. Затем колбу с субстратом помещают в кипящую водяную баню и выдерживают при непрерывном перемешивании до полного растворения бета-глюкана не более 20 мин. Далее субстрат охлаждают до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, доводят объем до метки буферным раствором и центрифугируют в течение 15 мин. при 7000 об./мин.

Раствор хранят в холодильнике не более 2-х суток.

9.1.3. Приготовление раствора меди сернокислой 5-водной, 10%

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см наливают около 70 куб. см дистиллированной воды. При перемешивании ее на магнитной мешалке вносят 10 г меди сернокислой 5-водной. Доливают до метки дистиллированной водой.

Раствор хранят в холодильнике до 3 месяцев.

9.1.4. Приготовление раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, 1/15 моль/куб. дм

Навеску 2,39 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и заполняют до метки дистиллированной водой.

Раствор хранят в холодильнике до одного месяца.

9.1.5. Приготовление раствора калия фосфорнокислого однозамещенного, 1/15 моль/куб. дм

Навеску 0,91 г калия фосфорнокислого однозамещенного помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и заполняют до метки дистиллированной водой.

Раствор хранят в холодильнике до одного месяца.

9.1.6. Приготовление фосфатного буферного раствора, рН 6,5

Смешивают приготовленные растворы калия и натрия фосфорнокислого концентрацией 1/15 моль/куб. дм в соотношении 7:3. Проверяют величину водородного показателя буферного раствора и, при необходимости, доводят ее одним из компонентов до требуемого значения.

Раствор хранят в холодильнике до одного месяца.

9.1.7. Приготовление растворов Шомодьи

Для приготовления раствора Шомодьи готовят растворы А и Б.

9.1.7.1. Приготовление раствора А.

Растворяют в 450 куб. см горячей дистиллированной воды 18,0 г сернокислого натрия и кипятят 40 мин. для удаления углекислого газа. Раствор охлаждают.

9.1.7.2. Приготовление раствора Б.

Растворяют в 250 куб. см дистиллированной воды 24,0 г натрия углекислого и 12 г калия-натрия виннокислого, затем добавляют 40 куб. см приготовленного раствора сернокислой меди и 16,0 г натрия углекислого кислого.

9.1.7.3. Приготовление раствора Шомодьи.

Раствор А и Б соединяют и объем доводят дистиллированной водой до 1 куб. дм в мерной колбе.

Раствор хранят в темной посуде с плотно притертой пробкой в темном месте при комнатной температуре не более 3-х месяцев.

9.1.8. Приготовление раствора Нельсона

Растворяют в 400 куб. см дистиллированной воды 25,0 г молибденовокислого аммония в мерной колбе вместимостью 500 куб. см при постоянном перемешивании, добавляют сначала 21,0 куб. см концентрированной серной кислоты и затем 3,0 г мышьяковокислого натрия, предварительно растворенного в 25 куб. см дистиллированной воды.

Объем полученного раствора доводят до метки дистиллированной водой и выдерживают в термостате при 36 - 40 °С в течение 2-х суток.

Реактив имеет желтую окраску. Хранят реактив в темной посуде с плотно притертой пробкой в защищенном от света месте при комнатной температуре не более 3-х месяцев.

9.1.9. Приготовление насыщенного раствора бензойной кислоты, 0,27%

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 2,7 г бензойной кислоты, приливают 700 куб. см дистиллированной воды и растворяют при нагревании в кипящей водяной бане. После растворения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят до метки дистиллированной водой.

Раствор хранят в холодильнике (4 - 6 °С) до 3-х месяцев.

Подготовку фотоэлектроколориметра проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины оптической плотности от массы анализируемого вещества в пробе, взятой для анализа, устанавливают при помощи градуировочных растворов бета-глюканазы в соответствии с табл. 1.

Градуировочные растворы приготавливаются непосредственно перед измерениями. Хранить не более 6 ч в бытовом холодильнике.

Во все пробирки шкалы наливают по 0,9 куб. см субстрата, предварительно термостатированного при температуре 50 °С в течение 10 мин. Затем добавляют по 0,1 куб. см каждого градуировочного раствора бета-глюканазы, включая раствор, не содержащий бета-глюканазу (раствор N 1 по табл. 1). Градуировочные растворы также предварительно термостатируют при 50 °С в течение 10 мин.

Через 10 мин. во все пробирки вносят по 1 куб. см раствора Шомодьи и прогревают в бурно кипящей водяной бане в течение 15 мин., после чего быстро охлаждают в проточной воде. В каждую из пробирок вносят по 1 куб. см реактива Нельсона и по 7 куб. см дистиллированной воды и выдерживают в течение 10 мин. для развития окраски.

Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 670 нм в кювете с толщиной оптического слоя 10 мм по отношению к холостому раствору.

Рабочая зона оптического поглощения для градуировочного графика располагается в пределах 0,14 - 0,86 D.

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности из пяти параллельных измерений.

По полученным значениям оптических плотностей строят градуировочный график.

Проверку градуировочного графика проводят 1 раз в 3 месяца или в случае смены партии реактивов, оборудования или приборов.

Воздух с объемным расходом 20 куб. дм/мин. аспирируют в течение 25 мин. через фильтр АФА-ВП-10, помещенный в фильтродержатель. Для определения 1/2 ОБУВ бета-глюканазы следует отобрать 500 куб. дм воздуха.

Отобранные пробы хранятся в условиях сухого помещения в закрытом сосуде при комнатной температуре до 5 суток.

Фильтр с отобранной пробой переносят в стаканчик, приливают в нее 5 куб. см раствора бензойной кислоты и оставляют на 10 мин., периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Полученный раствор отливают в пробирку, а экстракцию продолжают, добавив в стаканчик с фильтром 5 куб. см раствора бензойной кислоты. Затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в одну пробирку. Таким образом получают 10 куб. см элюата бета-глюканазы.

Анализ 0,1 куб. см элюата на содержание бета-глюканазы проводят точно так же, как при построении градуировочной характеристики.

Оптическую плотность анализируемого раствора измеряют аналогично градуировочным растворам по сравнению с холостым, который готовят одновременно и аналогично пробам, используя чистый фильтр.

По градуировочному графику находят количество бета-глюканазы в объеме пробы, взятой для анализа, соответствующее полученным значениям оптических плотностей.

Каждый элюат анализируют дважды.

Если значения оптических плотностей находятся за пределами рабочей зоны градуировочного графика, то опыт необходимо повторить с раствором, имеющим большее или меньшее содержание бета-глюканазы.

Концентрацию бета-глюканазы в воздухе (С, мг/куб. м) вычисляют по формуле:

где:

а - содержание бета-глюканазы, определенное в объеме пробы, взятой для анализа, мкг;

в - общий объем пробы, куб. см;

б - объем пробы, взятой для анализа, куб. см;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, куб. дм (см. Прилож. 1).

Результат количественного анализа представляют в виде (С +/- С х ДЕЛЬТА / 100) мг/куб. м, Р = 0,95, где ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, выраженная в процентах.

Значения полученных метрологических характеристик погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 2.

При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Периодичность проведения внутреннего оперативного контроля воспроизводимости и интервал времени между первичным и повторным анализами пробы устанавливают с учетом стабильности условий выполнения контрольных измерений; периодичности и длительности проведения КХА, устанавливаемых соответствующими нормативными документами; вариации состава анализируемых проб; плана выборочного статистического контроля воспроизводимости (как правило, интервал времени между получением первичного и повторного результатов КХА пробы составляет 1 - 3 дня).

Внутренний оперативный контроль точности проводят для каждого интервала определяемых концентраций. Единичные контрольные измерения выполняют в одной серии с КХА рабочих проб за период, в течение которого условия проведения КХА допустимо считать постоянными. Число контрольных измерений зависит от установленных планов статистического контроля точности.

Образцами для оперативного контроля точности являются стандартные образцы с известным содержанием измеряемого вещества, величина которого должна быть близкой к анализируемым пробам.

При контроле качества результатов КХА состава воздушных сред при отсутствии в лаборатории промышленных смесей или невозможности их создания, в качестве образца для контроля используют стандартный образец, нанесенный на фильтр или другое устройство, на которое концентрируют исследуемые вещества. При этом следует иметь в виду, что погрешность процедуры отбора проб контролируется путем поверки используемых пробоотборников, и расчет норматива контроля точности осуществляют, исходя из характеристики погрешности методики КХА за вычетом характеристики погрешности используемого пробоотборника и характеристики погрешности, связанной с неполным извлечением анализируемых компонентов.

Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

Для проведения серии анализов из 6 параллельных проб требуется 2,5 ч.

Методические указания разработаны Российским государственным медицинским университетом (А.В. Лиманцев).

Приведение объема воздуха к стандартным условиям (температура 20 °С и давление 101,33 кПа) проводят по формуле: