"МУК 4.1.1619-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Фотометрическое измерение массовых концентраций бета-галактозидазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Минздравом России 29.06.2003)

1. Методические указания подготовлены творческим коллективом специалистов Научно-исследовательского института медицины труда РАМН (Л.Г. Макеева - руководитель, Г.В. Муравьева, Е.М. Малинина, Е.Н. Грицун, Г.Ф. Громова) при участии А. И. Кучеренко (Департамент Госсанэпиднадзора Минздрава России).

2. Рекомендованы к утверждению на совместном заседании группы Главного эксперта Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию по проблеме "Лабораторно-инструментальное дело и метрологическое обеспечение" и методбюро п/секции "Промышленно-санитарная химия" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены труда и профпатологии".

3. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации.

4. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 29.06.03.

5. Введены впервые.

Методические указания "Измерение концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (выпуск 42) разработаны с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций вредных веществ их предельно допустимым концентрациям (ПДК) и ориентировочным безопасным уровням воздействия (ОБУВ) и являются обязательными при осуществлении санитарного контроля.

Включенные в данный сборник 29 методик контроля вредных веществ в воздухе рабочей зоны разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 ССБТ "Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования", ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений", МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа", МИ 2336-95 "Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритмы оценивания".

Методики выполнены с использованием современных методов исследования, метрологически аттестованы и дают возможность контролировать концентрации химических веществ на уровне и ниже их ПДК и ОБУВ в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах - ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны", ГН 2.2.5.1314-03 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны" и дополнениях N 1 к ним.

Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств.

Настоящие Методические указания устанавливают количественный фотометрический анализ воздуха рабочей зоны на содержание бета-галактозидазы в диапазоне массовых концентраций 2,0 - 20,0 мг/куб. м.

Бета-галактозидаза представляет собой фермент, получаемый при глубинном культивировании продуцента бета-галактозидазы - Penicillium canescens F-178. Обладает специфической бета-галактозидазной активностью, которая характеризуется способностью фермента расщеплять бета-галактозидазные связи с образованием галактозы.

Препарат предназначен для гидролиза лактозы молока и молочной сыворотки в молочной и хлебопекарной промышленности.

2.1. Физико-химические свойства.

Бета-галактозидаза - порошок светло-бежевого цвета, хорошо растворимый в воде.

Молекулярная масса - 120 кД.

Ферментативная активность - 5000 Ед/г.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика.

Бета-галактозидаза является малотоксичным веществом при поступлении в организм через желудочно-кишечный тракт, обладает слабым раздражающим действием на слизистые оболочки глаз.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) бета-галактозидазы в воздухе рабочей зоны - 4,0 мг/куб. м. Класс опасности - III, "А".

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций бета-галактозидазы с погрешностью, не превышающей +/- 22%, при доверительной вероятности 0,95.

Измерение массовой концентрации бета-галактозидазы выполняется методом фотометрии.

Метод основан на определении концентрации орто-нитрофенола, образующегося при действии фермента бета-галактозидазы на орто-нитрофенил-бета-D-галактопиранозид (НФГ). Измерение концентрации орто-нитрофенола проводят при длине волны 440 нм.

За единицу активности бета-галактозидазы принимают такое количество фермента, которое за 1 мин. гидролизует 1 мкмоль НФГ в стандартных условиях (30 °С, рН 4,2).

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания бета-галактозидазы в анализируемой пробе (1,0 куб. см) - 10,0 мкг.

Нижний предел измерения концентрации бета-галактозидазы в воздухе при отборе 50 куб. дм - 2,0 мг/куб. м.

Определению бета-галактозидазы не мешает наличие в воздухе инвертазы и ксиланазы.

Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели точности, установленные для данной МВИ.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

6.3. При выполнении измерений с использованием фотоэлектроколориметра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

Работа на фотоэлектроколориметре должна проводиться в чистом помещении, свободном от пыли, паров кислот и щелочей. Вблизи фотоэлектроколориметра не должны располагаться громоздкие изделия, создающие неудобства в работе оператора (ГОСТ 15150-69).

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим и средним специальным образованием, имеющие навыки работы на фотоэлектроколориметре.

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и влажности воздуха не более 80%.

8.2. Измерения на фотоэлектроколориметре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1.1. Приготовление стандартного раствора бета-галактозидазы, 1 г/куб. дм.

Количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см 0,1 г бета-галактозидазы, объем доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор готовят в день проведения анализа.

9.1.2. Приготовление раствора НФГ (субстрат), 0,01 моль/куб. дм.

Навеску НФГ 0,075 г количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 куб. см, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор может храниться в холодильнике в течение 3-х суток. Пожелтевший раствор к употреблению непригоден.

9.1.3. Приготовление раствора натрия углекислого, 1 моль/куб. дм.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см вносят 106 г натрия углекислого, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор может храниться до 6 месяцев в холодильнике.

9.1.4. Приготовление раствора кислоты уксусной, 0,2 моль/куб. дм.

В мерную колбу вместимостью 1 куб. дм вносят 11,6 куб. см уксусной кислоты. Доводят до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.

Раствор может храниться до года в посуде с притертой пробкой.

9.1.5. Приготовление раствора натрия уксуснокислого, 0,2 моль/л.

В мерную колбу вместимостью 1 куб. дм вносят 27,2 г натрия уксуснокислого. Доводят до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.

Раствор может храниться до 2-х месяцев в холодильнике.

9.1.6. Приготовление ацетатного буфера, 0,2 моль/куб. дм, рН 4.2.

Смешивают 73,5 куб. см раствора уксусной кислоты концентрацией (0,2 моль/куб. дм) с 26,5 куб. см раствора уксуснокислого натрия (0,2 моль/куб. дм), тщательно перемешивают. Водородный показатель проверяют на рН-метре.

Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 15 суток.

Подготовку фотоэлектроколориметра проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины оптической плотности от массы анализируемого вещества в пробе, взятой для анализа, устанавливают при помощи градуировочных растворов бета-галактозидазы в соответствии с табл. 1.

Градуировочные растворы готовятся непосредственно перед измерениями. Хранить не более 6 ч в бытовом холодильнике.

В пробирки наливают по 3,5 куб. см ацетатного буфера и 0,5 куб. см раствора НФГ (субстратный раствор), прогревают в ультратермостате при 30 °С 10 мин. Затем в пробирки вносят по 1 куб. см градуировочных растворов, перемешивают и включают секундомер. Пробирки выдерживают в ультратермостате 10 мин., после чего из них отбирают по 1 куб. см в ранее приготовленные пробирки, содержащие по 1 куб. см 1-молярного раствора углекислого натрия.

Холостую пробу получают путем последовательного добавления в пробирку 3,5 куб. см ацетатного буфера, 0,5 куб. см раствора НФГ (субстратный раствор) и 1 куб. см дистиллированной воды. Пробирки выдерживают в ультратермостате 10 мин. Далее отбирают 1 куб. см в подготовленную пробирку, содержащую 1 куб. см 1-молярного раствора углекислого натрия.

Во все пробирки добавляют по 8 куб. см дистиллированной воды. В результате общий объем жидкости в каждой пробирке составляет 10 куб. см.

Холостая проба практически бесцветна. Растворы, содержащие бета-галактозидазу, имеют желтую окраску, интенсивность которой тем сильнее, чем выше концентрация определяемого вещества.

Измеряют оптическую плотность растворов в кюветах с толщиной оптического слоя 30 мм при длине волны 440 нм по отношению к холостой пробе, не содержащей определяемого вещества (раствор N 1 по таблице).

Строят градуировочный график зависимости значения оптической плотности (при длине волны 440 нм, в кюветах толщиной оптического слоя 30 мм) от концентрации бета-галактозидазы.

Рабочая зона оптического поглощения для градуировочного графика лежит в пределах 0,1 - 1,1.

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности из пяти параллельных измерений.

Проверку градуировочного графика проводят 1 раз в 3 месяца или в случае смены партии реактивов, оборудования или приборов.

Воздух с объемным расходом 10 куб. дм/мин. аспирируют в течение 5 мин. через фильтр АФА-ВП-10, помещенный в фильтродержатель. Для определения 1/2 ПДК бета-галактозидазы следует отобрать 50 куб. дм воздуха.

Отобранные пробы хранятся в условиях сухого помещения в закрытом сосуде при комнатной температуре до 5 суток.

Фильтр с отобранной пробой переносят в бюкс, приливают в него 5 куб. см дистиллированной воды и оставляют на 10 мин., периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Полученный раствор отливают в пробирку, а экстракцию продолжают, добавив в стаканчик с фильтром 5 куб. см раствора дистиллированной воды. Затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в одну пробирку. Таким образом получают 10 куб. см элюата бета-галактозидазы.

Анализ 1,0 куб. см элюата на содержание бета-галактозидазы проводят точно так же, как при построении градуировочной характеристики.

Оптическую плотность анализируемого раствора измеряют аналогично градуировочным растворам по сравнению с холостым, который готовят одновременно и аналогично пробам, используя чистый фильтр.

По градуировочному графику находят количество бета-галактозидазы в объеме пробы, взятой для анализа, соответствующее полученным значениям оптических плотностей.

Если значения оптических плотностей находятся за пределами рабочей зоны градуировочного графика, то опыт необходимо повторить с раствором, имеющим большее или меньшее содержание бета-галактозидазы.

Массовую концентрацию бета-галактозидазы в воздухе (С, мг/куб. м) вычисляют по формуле:

где:

а - содержание бета-галактозидазы, найденное в анализируемом объеме раствора по градуировочному графику, мкг;

б - объем пробы, взятой для анализа, куб. см;

в - общий объем пробы, куб. см;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, куб. дм (см. Прилож. 1).

Результат количественного анализа представляют в виде (С +/- С х ДЕЛЬТА / 100) мг/куб. м, Р = 0,95, где ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, выраженная в процентах.

Значения полученных метрологических характеристик погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 2.

При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Внутренний оперативный контроль точности проводят для каждого интервала определяемых концентраций. Единичные контрольные измерения выполняют в одной серии с КХА рабочих проб за период, в течение которого условия проведения КХА допустимо считать постоянными. Число контрольных измерений зависит от установленных планов статистического контроля точности.

Образцами для оперативного контроля точности являются стандартные образцы с известным содержанием измеряемого вещества, величина которого должна быть близкой к анализируемым пробам.

При контроле качества результатов КХА состава воздушных сред при отсутствии в лаборатории промышленных смесей или невозможности их создания, в качестве образца для контроля используют стандартный образец, нанесенный на фильтр или другое устройство, на которое концентрируют исследуемые вещества. При этом следует иметь в виду, что погрешность процедуры отбора проб контролируется путем поверки используемых пробоотборников, и расчет норматива контроля точности осуществляют, исходя из характеристики погрешности методики КХА за вычетом характеристики погрешности используемого пробоотборника и характеристики погрешности, связанной с неполным извлечением анализируемых компонентов.

Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

Для проведения анализа требуется 2,5 ч.

Методические указания разработаны Российским государственным медицинским университетом (А.В. Лиманцев).

Приведение объема воздуха к стандартным условиям (температура 20 °С и давление 101,33 кПа) проводят по формуле: