"МУК 4.1.3580-19. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой концентрации N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-[3-(4-морфолинил)пропокси]-4-хиназолинамина (гефитиниб) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.10.2019)

1. Подготовлены ФГБНУ "Научно-исследовательский институт медицины труда") (Л.Г. Макеева, Н.С. Горячев, Н.Л. Полуэктова, Е.Н. Грицун).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 18 октября 2019 г.

3. Введены впервые.

Разработаны сотрудниками ООО "Алгама" (Н.П. Сергеюк), АО "Всесоюзный научный центр по безопасности биологически активных веществ" (М.И. Голубева, Л.И. Крымова), ФГБУ "Научный центр биомедицинских технологий ФМБА" (А.Ю. Савченко), ООО "ФНЦ "ИннофармаТех" (И.Е. Шохин), АНО "Международная ассоциация клинических фармакологов" (Г.В. Раменская), ФГБНУ "Научно-исследовательский институт медицины труда им. академика Н.Ф. Измерова" (Л.Г. Макеева, Н.С. Горячев).

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 205-15/RA.RU.311787-2016/2017.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации гефитиниба в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,001 - 0,008 мг/м³.

1.2. Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий Роспотребнадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научных и других организаций, осуществляющих исследования содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

2.1. Физико-химические свойства гефитиниба.

Структурная формула:

Эмпирическая формула C₂₂H₂₄ClFN₄O₃.

Молекулярная масса: 446,9.

Регистрационный номер CAS: 184475-35-2.

Гефитиниб - белый или с желтоватым оттенком кристаллический порошок с температурой плавления 193 - 198 °C. Практически нерастворим в воде, легко растворим в ледяной уксусной кислоте и диметилсульфоксиде, растворим в пиридине, трудно растворим в тетрагидрофуране, мало растворим в этаноле, метаноле, этилацетате, пропаноле и ацетонитриле.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика гефитиниба:

- противоопухолевое средство направленной терапии - ингибитор протеинкиназ, обладает цитостатическим действием, выраженным кумулятивным эффектом;

- при длительном воздействии существует потенциальный риск возникновения токсических эффектов, в особенности в отношении печени и почек, кожи, роговицы глаз, лимфоузлов, состава крови, а также риск оппортунистических инфекций (как следствие иммуносупрессии);

- оказывает канцерогенное действие и неблагоприятное влияние на репродуктивную систему;

- контроль гефитиниба в воздухе рабочей зоны следует проводить на уровне чувствительности метода не менее 0,001 мг/м³.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации гефитиниба метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности P = 0,95).

4.1. Измерение массовой концентрации гефитиниба выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. Метод основан на разделении гефитиниба и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией гефитиниба с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации гефитиниба в анализируемой пробе.

Измерение проводят при длине волны 247 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое содержание гефитиниба в анализируемом объеме пробы - 0,01 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации гефитиниба в воздухе - 0,001 мг/м³ (при отборе 2 000 дм³ воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления лекарственных форм на основе гефитиниба. Измерению не мешают вспомогательные вещества: лактоза моногидрат, целлюлоза микрокристаллическая, поливинилпирролидон, кроскармеллоза натрия, натрия лаурилсульфат, магния стеарат.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами, по ГОСТ 12.1.007, ГОСТ 12.1.005.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <15>.

--------------------------------

<15> ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны"; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

9.2. Приготовление основного раствора гефитиниба: основной раствор гефитиниба с массовой концентрацией 500 мкг/см³ готовят растворением (0,0500 +/- 0,0002) г гефитиниба в смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) в мерной колбе вместимостью 100 см³. Срок хранения раствора - в течение двух недель в хорошо укупоренной таре, в холодильнике, в защищенном от света месте.

9.3. Приготовление рабочего раствора гефитиниба N 1: рабочий раствор гефитиниба N 1 с массовой концентрацией 100,0 мкг/см³ готовят разбавлением 10,0 см³ основного раствора гефитиниба смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) в мерной колбе вместимостью 50 см³. Срок хранения раствора - в течение недели в хорошо укупоренной таре, в холодильнике, в защищенном от света месте.

9.4. Приготовление рабочего раствора гефитиниба N 2: рабочий раствор гефитиниба N 2 с массовой концентрацией 20,0 мкг/см³ готовят разбавлением 10,0 см³ рабочего раствора гефитиниба N 1 смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) в мерной колбе вместимостью 50 см³. Срок хранения раствора - в течение недели в хорошо укупоренной таре, в холодильнике, в защищенном от света месте.

9.5. Приготовление смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1): в мерной колбе вместимостью 1 000 см³ смешивают 500 см³ спирта метилового и 500 см³ воды особо чистой с объемным соотношением (1:1). Срок хранения раствора - в течение месяца в холодильнике.

9.6. Приготовление 1 н водного раствора натрия гидроокиси: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 4,0 г натрия гидроокиси, растворяют в воде особо чистой и доводят водой особо чистой до метки. Срок хранения раствора - в течение двух недель.

9.7. Приготовление буферного раствора с pH 7,2: навеску калия фосфорнокислого однозамещенного в количестве 13,6 г растворяют в воде особо чистой в мерной колбе вместимостью 1000 см³ и перемешивают до растворения вещества. Затем доводят объем водой особо чистой до метки и снова перемешивают. Устанавливают pH полученного раствора равным 7,2 +/- 0,2 с потенциометрическим контролем путем прибавления 1 н раствора натрия гидроокиси. Срок хранения раствора - в течение недели в холодильнике.

9.8. Приготовление подвижной фазы: смесь ацетонитрила и буферного раствора с pH 7,2 с объемным соотношением (1:1): в мерной колбе вместимостью 1000 см³ смешивают 500 см³ ацетонитрила и 500 см³ буферного раствора с pH 7,2. Перед использованием подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазируют. Срок хранения раствора в хорошо укупоренной таре - в течение недели в защищенном от света месте в холодильнике.

9.9. Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.10. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания гефитиниба в анализируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии и контрольного раствора N 0 согласно табл. 2.

На аэрозольные фильтры, помещенные в бюксы, наносят пипеткой вместимостью 1 см³ объемы рабочего раствора гефитиниба N 1 с массовой концентрацией 100,0 мкг/см³ и рабочего раствора гефитиниба N 2 с массовой концентрацией 20,0 мкг/см³ в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре и с помощью пипетки вместимостью 5,0 см³ приливают по 5,0 см³ смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10 см³. Фильтры повторно обрабатывают 5,0 см³ смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в те же пробирки и доводят объем до 10 см³ смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1). Аналогично обрабатывают аэрозольный фильтр (контрольный раствор).

Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы.

Инжектируют в хроматограф по 0,05 см³ каждого из градуировочных растворов (табл. 2) с помощью микрошприца.

По полученным данным методом абсолютной градуировки строят градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (приборные единицы) от содержания гефитиниба в анализируемом объеме градуировочных растворов (мкг).

9.11. Условия хроматографирования градуировочных растворов и анализируемых проб:

- подвижная фаза: смесь ацетонитрила и буферного раствора pH 7,2 с объемным соотношением (1:1).

9.12. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа (после ремонта и поверки прибора). Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.10 (соответствующих началу, середине и концу диапазона измерений) и анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где S_изм, S_гр - значение площади пика (приборные единицы) гефитиниба в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике, соответственно;

K_гр - норматив контроля, ,

где - границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное хроматографирование этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика не стабильна (условие (1) не выполняется для двух или более образцов градуировочных растворов), выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов (табл. 2) для установления градуировочной характеристики, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики ее устанавливают заново.

9.13. Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005 и приложения 9 к Р 2.2.2006-05.

Одновременно отбирают две пробы. При отборе проб фиксируется температура воздуха и атмосферное давление.

Воздух аспирируют через аналитический аэрозольный фильтр с площадью рабочей поверхности 20 см³, помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения массовой концентрации гефитиниба на уровне 0,001 мг/м³ отбирают не менее 2000 дм³ воздуха в течение 15 минут.

Срок хранения отобранных проб в бюксах в течение трех дней в холодильнике, в защищенном от света месте.

10.1. Аэрозольный фильтр с отобранной пробой и чистый аэрозольный фильтр помещают в бюкс, пипеткой вместимостью 5 см³ приливают 5 см³ смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1), периодически помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 15 минут для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 см³. Фильтр повторно обрабатывают 5 см³ смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1), оставляют на 15 минут, периодически помешивая при этом стеклянной палочкой, затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Раствор сливают в ту же пробирку, объем раствора доводят до 10 см³ смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1). Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу.

Хроматографический анализ проб выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Устанавливают содержание гефитиниба (в мкг) в анализируемом объеме пробы по градуировочной характеристике (п. 9.10).

Примечание. Фильтрование анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в смеси спирта метилового и воды особо чистой с объемным соотношением (1:1) вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственных форм гефитиниба.

11.1. Массовую концентрацию гефитиниба в воздухе рабочей зоны, C, мг/м³, вычисляют по формуле:

где а - содержание вещества в анализируемом объеме пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

B - общий объем пробы, см³;

б - анализируемый объем пробы, см³;

V₂₀ - объем воздуха, отобранный для анализа (дм³) и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1 к настоящим методическим указаниям).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

где C₁, C₂ - результаты параллельных определений массовой концентрации гефитиниба в воздухе, мг/м³;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики.

12.1. Результат количественного химического анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/м³;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация гефитиниба менее 0,001 мг/м³ (более 0,008 мг/м³)".

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сравнительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD_0,95 по формуле:

где C_ср1, C_ср2 - средние значения массовой концентрации гефитиниба, полученные в первой и второй лабораториях, мг/м³;

CD_0,95 - значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднее арифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в п. 5.3.3 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

При разногласиях руководствуются п. 5.3.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

13.2. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725, ГОСТ Р ИСО 5725-6 и показателя правильность по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Приведение объема воздуха к стандартным условиям при температуре 293 К (20 °C) и атмосферном давлении 101,33 кПа (760 мм рт. ст.):

где V_t - объем воздуха, отобранный для анализа, дм³;

P - барометрическое давление, кПа (101,33 кПа = 760 мм рт. ст.);

t - температура воздуха в месте отбора пробы, °C.

Для удобства расчета V₂₀ следует пользоваться таблицей коэффициентов (прилож. 2 к настоящим методическим указаниям). Для приведения воздуха к стандартным условиям надо умножить V_t на соответствующий коэффициент.